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Jan 23, 2024

Autophagie von Candida albicans-Zellen nach der Wirkung des Regenwurms Venetin

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14228 (2023) Diesen Artikel zitieren Metrikdetails Die vorliegenden Studien zeigen die Wirkung des Venetin-1-Protein-Polysaccharid-Komplexes, der aus dem gewonnen wird

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14228 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die vorliegenden Studien zeigen die Wirkung des Venetin-1-Protein-Polysaccharid-Komplexes, der aus der Zölomflüssigkeit des Regenwurms Dendrobaena veneta gewonnen wird, auf Zellen von Candida albicans. Sie sind eine Fortsetzung der Forschung zu Wirkmechanismen, zellulären Zielen und Arten des Zelltods. Nach der Einwirkung von Venetin-1 wurde eine verringerte Überlebensrate der Hefezellen festgestellt. Es wurde beobachtet, dass die Zellen im Vergleich zu den Kontrollen vergrößert und deformiert waren. Darüber hinaus wurde eine Zunahme der Anzahl von Zellen mit deutlich vergrößerten Vakuolen festgestellt. Der erkannte Autophagieprozess wurde mittels Differentialinterferenzkontrast, Fluoreszenzmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Autophagische Vesikel waren am besten nach Inkubation von Pilzzellen mit dem Venetin-1-Komplex in einer Konzentration von 50 und 100 µg mL−1 sichtbar. Die Veränderungen in den Vakuolen gingen mit Veränderungen in der Größe der Mitochondrien einher, was wahrscheinlich mit dem zuvor dokumentierten oxidativen Stress zusammenhängt. Die Aggregationseigenschaften von Venetin-1 wurden charakterisiert. Basierend auf den Ergebnissen des Zetapotentials an der Venetin-1/KCl-Grenzfläche wurde der pHiep = 4-Punkt bestimmt, d. h. das Zetapotential wird oberhalb von pH = 4 positiv und unterhalb dieses Wertes negativ, was die elektrostatischen Wechselwirkungen mit anderen beeinflussen kann Partikel rund um Venetin-1.

Lange vor dem Aufkommen der modernen westlichen Medizin und der pharmazeutischen Industrie wurde das Tierreich auf der Suche nach medizinischen Präparaten ausgebeutet. Regenwürmer waren in alten Kulturen eine Nahrungs- und Heilmittelquelle. Obwohl die dokumentierte Verbindung von Regenwürmern mit der Medizin bis ins Jahr 1340 n. Chr. zurückreicht1, wurden spezifischere wissenschaftliche Untersuchungen erst in den letzten Jahrzehnten durchgeführt. Diese Wirbellosen sind ein wesentlicher Bestandteil der Traditionellen Chinesischen Medizin, in der Präparate aus Regenwürmern zur Behandlung von über 80 Krankheiten eingesetzt werden, beispielsweise Asthma, Bluthochdruck, Geschwüren, Epilepsie, Blutgefäßerkrankungen oder Krebs. Regenwürmer werden seit langem nicht nur in China, Indonesien oder Japan, sondern auch in anderen Ländern des Fernen Ostens häufig zur Behandlung verschiedener chronischer Krankheiten eingesetzt2. In Burma und Laos wird die Körperflüssigkeit des Regenwurms zur Behandlung von Windpocken3 verwendet. Darüber hinaus werden in diesen Ländern Regenwürmer gebacken, pulverisiert und mit Kokoswasser gegessen, um die Genesung zu beschleunigen. Abkochungen von Regenwürmern gelten als Vitalitätsquelle für Frauen nach der Geburt. In Indien werden Infusionen zur Senkung von hohem Fieber sowie zur Behandlung von Verdauungs- und Nervenstörungen eingesetzt. In Korea wird allgemein angenommen, dass Regenwürmer die menschliche Gesundheit verbessern und vielen Krankheiten vorbeugen4. In Vietnam ist ein aus Regenwürmern hergestelltes Pulver ein wesentlicher Bestandteil vieler Medikamente zur Behandlung bakterieller und viraler Infektionen. Im Iran werden dem Brot gebackene Regenwürmer zugesetzt, um Harnsteine ​​aufzulösen. Auf der Insel Java gibt es spezielle Regenwurmkulturen, die nur für medizinische Zwecke bestimmt sind. In Südamerika verwenden die Ye'Kuan-Indianer Regenwürmer zum Verzehr und zur Behandlung von Malaria und Leukämie5.

Der Regenwurmkörper enthält viele Nährstoffe, die für die menschliche Gesundheit unerlässlich sind. Die wichtigsten davon sind Stearin- und Palmitinsäure, ungesättigte Fettsäuren, Phosphatide und Cholesterin. Diese Verbindungen sind nicht nur notwendig, sondern auch wirksam bei der Behandlung verschiedener Krankheiten6. Die Herstellung pharmakologisch wichtiger Verbindungen aus Regenwürmern ist ein neues Gebiet der modernen Medizin.

Die Wechselwirkungen zwischen Regenwürmern und Mikroorganismen sind noch nicht vollständig verstanden. Da die Lebensumgebung von Regenwürmern reich an Pilzorganismen ist, sind Pilze die Hauptnahrungsquelle für Regenwürmer7 und gleichzeitig verfügen diese Wirbellosen über Mechanismen, die sie vor pathogenen Arten schützen. Eine davon ist die Wirkung der Zölomflüssigkeit (CF), die nachweislich Pilzzellen abtötet8. Von den Rückenporen abgesondertes CF enthält viele bioaktive Verbindungen, z. B. Enzyme wie Proteasen9,10,11, Lysozyme12,13, Metalloenzyme14 und fibrinolytische Enzyme15 sowie Polysaccharide16, Proteine17,18,19 und Nährstoffe usw. Diese Faktoren wirken antibakteriell20 ,21, antimykotische8,22, entzündungshemmende23, antioxidative23,24 und krebsbekämpfende10,11,25,26,27 Wirkung.

Jedes Jahr werden bei 800 Millionen Patienten weltweit invasive Pilzinfektionen diagnostiziert, die 1.660.000 Todesfälle verursachen28,29,30, was mehr ist als die Sterblichkeitsrate von Escherichia coli (950.000 Todesfälle) oder HIV/AIDS (864.000 Todesfälle)31. Die Hauptursache für schwere Pilzinfektionen ist Candida albicans, die 70 % aller durch Pilze verursachten Krankheiten ausmacht, mit einer Sterblichkeitsrate von bis zu 50 %30,32,33,34. Die durch diesen Hefepilz verursachte systemische Candidose ist nachweislich die zweithäufigste Todesursache bei Frühgeborenen35. Infektionen mit C. albicans stellen auch auf Intensivstationen ein ernstes Problem dar, wo es der am häufigsten bei Patienten aus Europa isolierte Erreger ist und der vierthäufigste in den USA36,37,38.

Candida albicans verdankt seinen Erfolg in der Pathogenese einigen Faktoren. Einer davon ist, dass dieser Pilz als Kommensal auf der menschlichen Haut, den Schleimhäuten und im Darm vorkommt39,40,41. Die Vermehrung von Hefepilzen wird durch das Immunsystem kontrolliert, kann sich jedoch der Immunität entziehen, wenn der Organismus geschwächt ist. Zu den Risikofaktoren für die Entwicklung einer Candidämie gehören Antibiotikabehandlung, Operationen, Chemotherapie, HIV-Infektion, extremes Alter, Verwendung medizinischer Geräte oder längerer Krankenhausaufenthalt39,42,43,44. Unter günstigen Bedingungen ändern Hefen ihr Wachstumsmodell von einzellig zu Hyphen oder Pseudohyphen, bilden Biofilm und haften an biotischen und abiotischen Oberflächen, wodurch sie schwer zu entfernen sind39,41,43,45,46. Biofilme sind außerdem sehr resistent gegen Antibiotika und stellen eine ernsthafte Gefahr für Patienten dar. Der antibiotischen Behandlung von Candidiasis sind durch die Toxizität der Medikamente Grenzen gesetzt, die bei zu schwachen Patienten nicht verabreicht werden dürfen. Eine weitere Einschränkung ist die zunehmende Antibiotikaresistenz von Pilzen. Veränderungen im genetischen Material von C. albicans führen zum Auftreten von Multi-Drug-Pumps oder Veränderungen in den Stoffwechselwegen, was Antibiotika unwirksam macht39,47,48.

Das Venetin-1-Nanopartikel – eine Protein-Polysaccharid-Fraktion (oder ein Komplex) mit antimykotischer Aktivität gegen C. albicans – wurde aus CF des Regenwurms Dendrobaena veneta isoliert. Seine Eigenschaften und sein chemischer Charakter wurden in früheren Veröffentlichungen beschrieben49,50,51,52. Es wurde gezeigt, dass das Nanopartikel krebshemmende25,53, antiaggregierende54 und immunstimulierende Eigenschaften55 hat. Wichtig ist, dass es keine Endotoxizität und Zytotoxizität gegenüber normalen menschlichen Zellen zeigt49. Venetin-1 hat die Fähigkeit, das 20S-Proteasom zu hemmen56. Ziel der vorliegenden Forschung war es, das Nanopartikel und den Mechanismus seiner Wirkung auf die Zellen des Pilzes C. albicans weiter zu charakterisieren.

Ringelwürmer der Art D. veneta wurden unter kontrollierten Bedingungen in der Abteilung für Immunologie der Maria-Cure-Skłodowska-Universität in Lublin gehalten. Die Regenwürmer wurden in mit Komposterde gefüllten 3-Liter-Kunststoffbehältern im Dunkeln bei einer Temperatur von 20 °C und einer Luftfeuchtigkeit von etwa 70–80 % gezüchtet. Die Regenwürmer wurden zweimal pro Woche mit gekochtem Gemüse gefüttert. Die Nahrung wurde mit reiner Zellulose ergänzt, die für die Herstellung von Kokons benötigt wurde. Für die Experimente wurden erwachsene Exemplare ausgewählt (Abb. 1).

Ausgewachsene D. veneta-Individuen.

Die Regenwürmer wurden zweimal mit destilliertem Wasser gespült und 24 Stunden lang in einen mit feuchtem Cellulose-Lignin gefüllten Plastikbehälter überführt, um ihren Verdauungstrakt zu reinigen. Als nächstes wurde eine Gruppe von 10 Regenwürmern in ein Becherglas gegeben, mit 0,9 % NaCl übergossen und 30 s lang mit einem elektrischen Strom von 4,5 V stimuliert. Der auf diese Weise erhaltene CF wurde 10 Minuten lang bei 2400 × g zentrifugiert, um die Coelomozyten vom Überstand abzutrennen. Der Überstand wurde dann durch 0,22-µm-Millipore-Filter filtriert und 10 Minuten bei 70 °C inkubiert. Anschließend wurde das Präparat in Zellulosebeuteln mit einem Cut-off-Punkt von 12–14 kDa dialysiert. Die Dialyse wurde 24 Stunden lang bei 4 °C durchgeführt. Die resultierende Flüssigkeit wurde dann in Eppendorf-Röhrchen überführt und lyophilisiert. Die vorbereitete Substanz wurde in einem Gefrierschrank (−20 °C) gelagert. Zu Versuchszwecken wurde die Proteinkonzentration mit der Bradford-Methode57 gemessen.

Das klinische Isolat des C. albicans-Wildtypstamms, gestiftet von Prof. A. Kędzia von der Abteilung für Orale Mikrobiologie der Medizinischen Universität Danzig (Polen), und Candida krusei (Issatchenkia orientalis) ATCC 6258 (aus der Sammlung der Abteilung). für Immunbiologie, Maria-Curie-Skłodowska-Universität in Lublin, Polen) wurden für die mikrobiologische Analyse herangezogen.

Die Zellkultur von C. albicans wurde auf festem Sabouraud-Medium gehalten. Für das Experiment wurden Hefezellen 24 Stunden lang bei 28 °C in flüssigem Sabouraud-Medium gezüchtet. 20 µL der Hefezellkultur (107 KBE) in „schlechtem“ YPD-Medium51 wurden mit 30 µL Streptomycinsulfat (Sigma) (Wasserlösung mit einer Konzentration von 1,4 mg mL−1) und Venetin-1 in einer Konzentration von 25 µg inkubiert ml−1, 50 µg ml−1 und 100 µg ml−1. Das Endvolumen der Zellkulturen betrug 250 µL. Die Kontrollkultur wurde ohne Zusatz von Venetin-1 hergestellt. Die Zellkulturen wurden 48 Stunden lang bei 37 °C unter ständigem Schütteln inkubiert.

Hefezellen aus der Kontrollkultur und Zellen nach der Inkubation mit Venetin-1 wurden auf einen Objektträger mit einem Volumen von 2 µl übertragen, mit einem Deckglas abgedeckt und bei 60-facher Vergrößerung unter Verwendung eines optischen Mikroskops Olympus BX61 (Olympus) beobachtet , Japan) mit DIC-Einstellungen. Die Zellen wurden mit dem ImageJ-Programm (National Institute of Health, USA) gemessen. Es wurden 200 Zellen in jeder Konzentration gemessen.

Die Hefekulturen wurden zentrifugiert und der Überstand in einem Fixiermittel pH = 7 (Phosphatpuffer, Glutaraldehyd, Saccharose) suspendiert und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde das Fixiermittel verworfen und 0,1 M Phosphatpuffer hinzugefügt. Als nächstes wurde 1,5 % OsO4 zu den pelletierten Zellen gegeben und 30 Minuten lang bei 2500 × g zentrifugiert. Anschließend wurde OsO4 entfernt und die Zellen in 0,1 M Phosphatpuffer resuspendiert und 30 Minuten bei 2500 × g zentrifugiert. Danach wurden die Zellen in Acetonlösungen mit steigenden Konzentrationen dehydriert: bei 30 %, 50 %, 70 % und zweimal bei 100 %. Die Zellkulturen wurden auf REM-Tische übertragen, 24 Stunden in einem Exsikkator mit Kieselgel gelagert und mit Gold besputtert (K550X Sputter Coater, Quorum Technologies). Die Zellen wurden mit einem Vega 3 Rasterelektronenmikroskop (Tescan, Tschechische Republik)49 abgebildet.

Proben mit Kontrollzellen von C. albicans und Zellen nach Inkubation mit Venetin-1 wurden zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 200 µL einer GH-Lösung suspendiert, zentrifugiert (10 Min., 6000 × g) und fast der gesamte Überstand wurde abgezogen. Die Pilzzellen in der GH-Lösung wurden 12 Minuten lang bei –92 °C in eine Sublimationskammer gegeben. Anschließend wurden die Proben mit einer speziellen Klinge in der Vorbereitungskammer geschnitten und mit einem EM ZEISS Ultra Plus SEM-Mikroskop (Carl Zeiss, Deutschland) bei 5 kV beobachtet.

Candida albicans-Zellen für die Färbung mit Fluorochromen wurden wie zuvor in „Mikroorganismen“ beschrieben vorbereitet. Zellsuspensionen wurden dann mit verschiedenen Fluorochromen unter geeigneten Bedingungen inkubiert, um Zellorganellen sichtbar zu machen. Gefärbte Hefezellen wurden unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops (Carl Zeiss, Deutschland) mit Immersion beobachtet.

Chinacrin-Dihydrochlorid (Sigma-Aldrich) färbt saure Organellen wie autophagische Körper (gelbliche Fluoreszenz) und Autophagosomen (blaue Fluoreszenz). Pilzzellen für die Chinacrin-Dihydrochlorid-Färbung wurden in einem Anteil von 10 µL der Zellsuspension mit 10 µL Fluorochrom (1 mg mL-1 Wasserlösung) gemischt und 10 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. 2 µl Zellsuspension wurden auf einen Objektträger übertragen, mit einem Deckglas abgedeckt und bei einer Anregungswellenlänge von 436 nm für Quinacrine beobachtet.

Der LIVE/DEAD-Test dient der Unterscheidung zwischen stoffwechselaktiven, inaktiven und toten Zellen. Allerdings werden auch Zellorganellen wie Mitochondrien gefärbt. Für das Experiment wurden C. krusei-Zellen auf die gleiche Weise wie die C. albicans-Zellen vorbereitet. Die Hefezellsuspensionen wurden zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Pellets in GH-Puffer suspendiert. Anschließend wurden die Hefezellkulturen mit 10 % FUN-1 in GH-Puffer im Verhältnis 1:1 gemischt und 30 Minuten bei 30 °C inkubiert. 2 µL der gefärbten Zellen wurden auf Objektträger übertragen und Fluoreszenz wurde bei einer Emissionswellenlänge von 480 nm beobachtet49. Zellen mit roten Einfügungen im Zytoplasma galten als aktiv, grüne und gelbe Zellen galten als inaktiv. Mitochondrien fluoreszierten gelbgrün an der Peripherie der Zellen.

Acridinorange (AO) ist ein Fluorochrom, das eine Affinität zu Nukleinsäuren und sauren Zellkompartimenten anzeigt. Eine AO-Wasserlösung (0,1 mg mL−1) wurde mit der Hefezellsuspension im Verhältnis 1:1 gemischt und 10 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Proben in einem Volumen von 2 µL wurden auf ein Deckglas gegeben und bei der Anregungswellenlänge λ = 502 nm und der Emissionswellenlänge λ = 526 nm unter Verwendung eines Zeiss/LEO 912AB-Mikroskops bei 1000-facher Vergrößerung beobachtet51. Die Zellen, die den Autophagieprozess durchlaufen, wurden nach der Acridinorange-Färbung mit dem ImageJ-Programm unter Verwendung des Multitools gezählt. In jeder Probe wurden etwa 500 Zellen gezählt und das Experiment dreimal wiederholt.

Hefezellkulturen (Herstellung beschrieben in „Mikroorganismen“) wurden in GA (4 % Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer, pH = 7,2) fixiert. Als nächstes wurden die C. albicans-Kulturen zentrifugiert (2500 × g, 12 Min.) und zweimal mit 0,1 M Cacodylatpuffer unter Zentrifugation (2500 × g, 12 Min.) gespült. Anschließend wurde das Pellet 1 Stunde und 15 Minuten lang bei 5 °C in 1,5 % KMnO4 fixiert. Nach dieser Zeit wurden die Zellen mehrmals mit destilliertem Wasser gespült, bis sie sich verfärbten. Eingebettete Pilzzellen wurden dann mit 1 % Uranacetat kontrastiert, mit anschließenden Konzentrationen von Ethanol dehydriert, infiltriert und in Harz (LR White) eingebettet. Die Harzblöcke wurden dann in ultradünne Abschnitte geschnitten und mit einem Transmissionselektronenmikroskop JEM-1400Flash (JEOL, Japan) beobachtet.

Die Durchflusszytometrie-Analyse lebender/toter Hefezellen wurde mit einer Mischung aus Propidiumiodid (10 µg mL-1 Wasserlösung) und Hoechst 33342 (5 µg mL-1 Wasserlösung) im Verhältnis 2:1 durchgeführt. Die Zellkulturen wurden mit einer Färbemischung 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert; Anschließend wurde destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 800 µL zugegeben58. Die Analyse wurde mit einem Guava easyCyte-Durchflusszytometer (Luminex, USA) mit einem 695/50-nm-Laser (Red-B-HLog), einem 785/70-nm-Laser (NIR-R-HLog) und Vorwärtsstreuung (FSC-HLog) durchgeführt ), Side Scatter (SSC-HLog), Schwellenwert auf FSC auf 68 eingestellt und die Gesamtzahl der gezählten Zellen 5000. Die erhaltenen Punktdiagramme wurden mit dem Quad Stat Marker für lebensfähig (oberes linkes Quadrat) und tot (unten links) markiert quadratische) Zellbereiche.

Venetin-1 wurde in einer Konzentration von 1 mg mL-1 10 Minuten lang bei 40 °C in einer Ultraschallkammer (Pol-Sonic, Polen) mit Ultraschall behandelt. Anschließend wurde die Probe in einer Wasserlösung auf dem mit Quantifoil R 2/2-Kohlenstofffilm (Quantifoil Micro Tools GmbH, Großlöbichau, Deutschland) bedeckten TEM-Gitter vitrifiziert. Vor den Beobachtungen wurden die Gitter 15 s lang mit Sauerstoffplasma in einem Femto-Plasmareiniger (Diener Electronic, Deutschland) aktiviert. Als nächstes wurden 3 μl der Venetin-1-Suspension auf das Gitter übertragen, mit Filterpapier abgetupft und zum sofortigen Einfrieren durch Vitrobot Mark IV (FEI Company, USA) in flüssiges Ethan getaucht. Vor den Beobachtungen wurden die Proben in flüssigem Stickstoff gelagert. Um die Proben in das TEM-Mikroskop zu übertragen, wurden sie in den Gatan 626 Cryo-TEM-Halter (Gatan Inc., USA)59 geladen. Die Proben wurden unter Verwendung eines Tecnai F20 X TWIN-Mikroskops (FEI Company, USA) mit einer Beschleunigungsspannung von 200 kV der Emissionskanone beobachtet. Zur Aufnahme der Bilder wurde eine Eagle 4k HS-Kamera (FEI Company, USA) verwendet.

Zur Charakterisierung des Venetin-1-Nanopartikels wurde die DLS-Technik mit dem Prometheus Panta verwendet. Es liefert Daten höchster Qualität zu den biophysikalischen Eigenschaften des analysierten Materials. Venetin-1 wurde in einer Konzentration von 1,3 mg mL−1 in Wasser gelöst. Die Proben wurden in acht Kapillaren geladen, die als Repliken dienten, wo eine parallele Analyse es uns ermöglichte, die Homogenität der Nanopartikel und ihre Aggregationsfähigkeiten unter verschiedenen Temperaturbedingungen zu analysieren.

Die Messungen der elektrophoretischen Mobilität, Leitfähigkeit und des Zetapotentials der NaCl-Lösung mit einer Konzentration von 10–4, 10–3 M und 10–3 M KCl wurden mit dem Zetasizer Nano ZS90 von Malvern durchgeführt. Aufgrund des Wertes von κa ~ 150 wurde die Smoluchowsky-Gleichung angewendet. Die Messungen wurden bei einer festen Konzentration von Venetin-1 von 100 ppm durchgeführt. Die Verbindung wurde der Lösung zugesetzt und mit der Ultraschallsonde Sonicator XL 2020 von Misonix dispergiert. Anschließend wurde die Suspension in 125-ml-Kolben gegossen und mit 0,1 M HCl- und NaOH-Lösungen ein pH-Wert im Bereich von 3–11 eingestellt. Für jede Lösung wurden fünf Messungen der elektrophoretischen Mobilität, Leitfähigkeit und des Zetapotentials durchgeführt.

Alle Messungen wurden mit einem Fluostar Omega-Mikroplattenlesegerät (BMG Labtech, Deutschland) und schwarzen oder transparenten 96-Well-Platten (BRAND, Deutschland) durchgeführt. Rekombinantes Rindertrypsin wurde von Sigma-Aldrich (Deutschland) gekauft und Chymotrypsin wurde von Bachem (Deutschland) bereitgestellt. Die rekombinante katalytische Domäne der menschlichen Matriptase-1/ST14 wurde von R&D Systems (USA) erworben. Rekombinante humane Matriptase-2 wurde von Enzo Life Sciences (Schweiz) erhalten. Lösliches humanes rekombinantes Furin wurde freundlicherweise von Dr. Anna Kwiatkowska60 aus der Gruppe von Prof. Robert Day (Université de Sherbrooke, Kanada) zur Verfügung gestellt.

Die folgenden Testpuffer wurden verwendet: 50 mM Tris-Cl, pH 8,3 mit 20 mM CaCl2 (Trypsin und Chymotrypsin), 50 mM Tris-HCl pH 8,3 mit 150 mM NaCl und 0,01 % Triton X 100 (Matriptase-1 und Matriptase-1). 2) und 100 mM HEPES pH 7,5 mit 1 mM CaCl2 und 1,8 mg mL−1 Rinderserumalbumin (Furin). Die folgenden chromogenen oder fluorogenen Substrate wurden in den Tests verwendet: Nα-Benzoyl-d,l-arginin-4-nitroanilidhydrochlorid (BAPNA, Bachem, Deutschland) in einer Endkonzentration von 4,60 mM für Trypsin, Suc-Ala-Ala-Pro- Leu-pNA (Bachem, Deutschland) in einer Endkonzentration von 1,69 mM für α-Chymotrypsin, Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (Pepta Nova, Deutschland) in einer Endkonzentration von 5 µM für Matriptase-1 (MT1) und Matriptase-2 (MT2) und Pyr-Arg-Thr-Arg-AMC (Pepta Nova, Deutschland) in einer Endkonzentration von 20 µM für Furin. Die Konzentrationen der Enzyme waren wie folgt: 138 nM Trypsin, 141 nM Chymotrypsin, 1,25 ng ml MT1, 1,51 U ml MT2 und 1,1 nM Furin.

Die Konzentration der Rindertrypsin-Stammlösung wurde spektrophotometrisch bei 410 nm durch Titration mit dem chromogenen Burst-Substrat 4-Nitrophenyl-4-guanidinobenzoat (NPGB, Sigma-Aldrich, USA) bestimmt. Später wurde die standardisierte Trypsinlösung zur Titrierung der dritten Domäne OMTKY-3 (Sigma-Aldrich, USA, verwendet als gegenseitiger Inhibitor von Trypsin und Chymotrypsin) mit BAPNA als Substrat verwendet. Anschließend wurde OMTKY-3 verwendet, um die Konzentration der α-Chymotrypsin-Stammlösung in Gegenwart seines Substrats Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA zu bestimmen. Bei MT1 und MT2 wurden die Konzentrationen gemäß den Angaben der Lieferanten berechnet.

Die getestete Verbindung wurde der entsprechenden Protease in verschiedenen Konzentrationen zugesetzt und 30 Minuten lang bei 37 °C in Testpuffer inkubiert. Nach dieser Zeit wurde die Lösung eines geeigneten Substrats hinzugefügt. Die Reaktionen wurden mindestens 35 Minuten lang bei 37 °C überwacht. Das Endvolumen in jeder Vertiefung betrug 200 µL. Die Messungen wurden mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 380 nm und 450 nm (für die Substrate MT1, MT2 und Furin) durchgeführt und die Absorption der Trypsin- und Chymotrypsin-Substrate wurde bei 410 nm überwacht. Die prozentuale Hemmung eines Enzyms wurde relativ zur Kontrollprobe ohne den Inhibitor berechnet. Die Bestimmung der inhibitorischen Aktivitäten erfolgte nach Gitlin et al.61 und Gitlin-Domagalska et al.62.

Die IC50-Werte (Inhibitorkonzentrationen, die eine 50-prozentige Hemmung der Enzymaktivität ergeben) wurden aus Diagrammen der Enzymaktivität (% der Kontrollprobe) gegenüber der Inhibitorkonzentration unter Verwendung eines Vier-Parameter-Anpassungsmodells (GraFit 5.0.12 Erithacus Software Ltd.) berechnet. Die IC50-Werte wurden aus Dreifachmessungen mit mindestens zehn verschiedenen Inhibitorkonzentrationen ermittelt.

Statistische Analysen zur Beurteilung von Veränderungen in der Anzahl von C. albicans-Zellen mit autophagischen Körpern und Veränderungen in der Zellgröße nach der Behandlung mit Venetin-1 wurden mit dem Statistica-Programm (Tibco Software Inc., USA; Seriennummer: JPZ009K288211FAACD-Q) durchgeführt ). Zur Überprüfung der Art der Datenverteilung wurde der Shapiro-Wilk-Test und zur Bestimmung der Varianzhomogenität der Levene-Test eingesetzt. Der Post-hoc-Tukey-HSD-Test und die einfache ANOVA wurden verwendet, um das Signifikanzniveau von Unterschieden in der Anzahl der Zellen mit autophagischen Körpern und Veränderungen in der Zellgröße zu untersuchen.

Die durchflusszytometrische Analyse von mit Venetin-1 behandelten C. albicans-Zellen, die mit einer Mischung aus Hoechst 33342 und Propidiumiodid durchgeführt wurde, zeigte signifikante Veränderungen in der Menge an toten Zellen in mit Venetin-1 behandelten Kulturen im Vergleich zur Kontrollkultur (Abb. 2). ). Die obere linke Seite des Punktdiagramms zeigt, dass 86 % der Zellen in der Kontrollkultur lebensfähig waren. Nach der Inkubation mit Venetin-1 sank der Spiegel auf 62,34 %, 56,34 % und 30,02 % in Kulturen nach Behandlung mit Wirkstoff bei 25 µg mL-1, 50 µg mL-1 bzw. 100 µg mL-1.

Durchflusszytometrie-Analyse lebensfähiger und toter Zellen unter Verwendung einer Fluorochrommischung aus Hoechst 33342 und Propidiumiodid. Das obere linke Viertel öffnet lebensfähige Zellen; Das untere linke Viertel führt zu toten Zellen.

Kontrollzellen von C. albicans und solche, die mit Venetin-1 behandelt wurden, wurden mittels REM abgebildet. Die Morphologieanalyse ergab, dass die Zellen der Kontrollkultur eine ovale Form und eine raue, aber regelmäßige Zellwand aufwiesen (Abb. 3A1–A2). Nach der Inkubation mit Venetin-1 bei einer Proteinkonzentration von 50 µg mL−1 zeigten die Hefezellen sichtbare Veränderungen. Die dem Wirkstoff ausgesetzten Zellen vergrößerten sich im Vergleich zu den Kontrollzellen deutlich (Abb. 3B1–B2). Darüber hinaus zeigt Abb. 3B1 eine Zelle mit abgeblätterter Außenschicht der Zellwand, und in Abb. 3B2 ist eine Verformung der Zellform sichtbar. Nach der Behandlung mit Venetin-1 bei 100 µg mL−1 (Abb. 3C1–C2) wurden vergrößerte Zellen (Abb. 3C1–C2) sowie Zellen mit zahlreichen Teilungsnarben und geschrumpften Formen beobachtet (Abb. 3C2). Die durchschnittliche Zellgröße betrug 5,67 µm in der Kontrollzellkultur, 7,28 µm in der mit Venetin-1 in der Konzentration von 25 µg mL−1 behandelten Kultur, 7,1 µm in der Variante mit der Konzentration von 50 µg mL−1 und 7,37 µm in der Variante mit der Konzentration von 50 µg mL−1 µm bei der Behandlung mit einer Konzentration von 100 µg mL−1 (Ergänzende Informationstabelle S1, Abb. S1). Die parametrische Datenverteilung wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test bestimmt (Ergebnisse in der Ergänzungstabelle S1). Die Levene-Testergebnisse (F(3, 795) = 12,3181; p < 0,001) zeigten inhomogene Varianzen. Die statistische Signifikanz wurde mit dem Post-hoc-Tukey-HSD-Test und der einfaktoriellen ANOVA analysiert: F(3, 795) = 219,12; p < 0,001.

REM-Bilder von C. albicans-Zellen. (A1,A2) C. albicans-Zellen der Kontrollkultur, (B1,B2) C. albicans-Zellen nach Inkubation mit Venetin-1 bei 50 µg mL−1, (C1,C2) bei 100 µg mL−1. Die Bilder (B1–C2) zeigen vergrößerte und deformierte Zellen. Der Maßstabsbalken repräsentiert 2 µm.

Die C. albicans-Kontrollkulturzellen und die mit Venetin-1 behandelten Zellen wurden durch DIC abgebildet. Die Kontrollkulturzellen hatten eine ovale Form mit einer Vakuole, die nicht mehr als die Hälfte des Zelllumens ausmachte (Abb. 4A). Nach der Exposition gegenüber dem Präparat in einer Konzentration von 50 µg mL−1 wurden vergrößerte Zellen mit deutlich vergrößerten Vakuolen beobachtet, die den größten Teil des Zelllumens einnahmen (Abb. 4B). Am äußeren Rand der Vakuole waren kleine Vesikel (Autophagosomen) (in Abb. 4B mit roten Pfeilen markiert) erkennbar. Nach der Inkubation der Hefezellen mit Venetin-1 in einer Konzentration von 100 µg mL−1 traten neben vergrößerten Vakuolen und Autophagosomen (markiert durch rote Pfeile) auch Vesikel auf, die in die Vakuole eindrangen oder bereits darin vorhanden waren (markiert durch grüne Pfeile). in Abb. 4C,D; autophagische Körper). Nach der Exposition gegenüber dem Präparat in einer höheren Konzentration (100 µg mL−1) bildeten sich deutlich mehr Vesikel um die Vakuole herum als bei der Behandlung mit dem Komplex in einer Konzentration von 50 µg mL−1. Bei der Aufnahme durch Vakuolen verloren sie ihre regelmäßige runde Form.

DIC- und Kryo-SEM-Bilder von C. albicans-Zellen: (A–D) DIC-Bilder: (A) Kontrollkulturzellen, (B) Zellen nach Inkubation mit Venetin-1 in einer Konzentration von 50 µg mL−1, (C, D) bei einer Konzentration von 100 µg mL−1. (E,F) Kryo-SEM-Bilder von Zellen nach Behandlung mit Venetin-1 bei 100 µg mL−1. Die roten Pfeile zeigen Autophagosomen; Die grünen Pfeile markieren autophagische Körper. Der Maßstabsbalken entspricht 2 µm.

Die Bilder E und F in Abb. 4 zeigen einen Querschnitt einer C. albicans-Zelle nach der Behandlung mit Venetin-1 in einer Konzentration von 100 µg mL−1, aufgenommen mit Kryo-SEM. Die Bilder E und F zeigen Vakuolen und Autophagosomen (mit Pfeilen markiert). Große Vakuolen sind in Abb. 4E sichtbar und ein vergrößerter Zellkern ist in Bild Abb. 4F dargestellt.

Die Chinacrin-Dihydrochlorid-Färbung zeigte das Vorhandensein blauer und blaugrüner Vesikel, die sich sowohl innerhalb als auch außerhalb der Vakuolen befanden (Abb. 5I). Die Färbung zellulärer Strukturen in den dargestellten Bildern ist unspezifisch. In den Kontrollzellen der C. albicans-Kultur wurde keine Vesikelfluoreszenz beobachtet. Im mikroskopischen Bild waren nur die Umrisse von Vakuolen normaler Größe zu erkennen (Abb. 5I A1–A2). Die mit Venetin-1 in einer Konzentration von 50 µg mL−1 behandelten C. albicans-Zellen zeichneten sich durch größere Zell- und Vakuolengrößen als in der unbehandelten Kultur aus. Sowohl Autophagosomen, also Vesikel, die sich außerhalb des Vakuolenlumens befinden (angezeigt durch rote Pfeile), als auch autophagische Körper, also Vesikel, die sich innerhalb der Vakuolen befinden (angezeigt durch gelbe Pfeile), waren sichtbar (Abb. 5I B1, B2). Die mit Venetin-1 in einer Konzentration von 100 µg mL-1 behandelten C. albicans-Zellen wiederum wiesen eine größere Menge beider Arten autophagischer Vesikel auf: Autophagosomen (rote Pfeile) und autophagische Körper (gelbe Pfeile). Die Größe der Vakuolen unterschied sich nicht von der normalen Größe (Abb. 5I C1–C4).

Autophagie in C. albicans-Zellen, visualisiert mit verschiedenen Fluorochromen. (I) Färbung mit Chinacrin-Dihydrochlorid: A1–A2–C. Albicans kontrollieren Kulturzellen; B1–B2–C. Albicans-Zellen nach Inkubation mit Venetin-1 in einer Konzentration von 50 µg mL−1; C1–C4 – bei einer Konzentration von 100 µg mL−1. Die roten Pfeile deuten auf Autophagosomen hin, die gelben Pfeile auf autophagische Körper. (II) Färbung mit Acridinorange: A1–A2–C. Albicans kontrollieren Kulturzellen; B1–B2–C. Albicans-Zellen nach Inkubation mit Venetin-1 in einer Konzentration von 50 µg mL−1; C1–C4 – bei einer Konzentration von 100 µg mL−1. Die weißen Pfeile zeigen Zellen mit autophagischen Vesikeln mit saurem pH-Wert. Der Maßstabsbalken entspricht 1 µm.

Die obigen Beobachtungen wurden durch die Analyse von C. albicans-Zellen bestätigt, die mit Acridinorange (AO) durchgeführt wurde, das saure Zellkompartimente orange oder rot färbt. Dieses Fluorochrom wird verwendet, um autophagische Zellen mit charakteristischen rot fluoreszierenden Vesikeln anzufärben (Abb. 5II). Das mikroskopische Bild der Kontrollkultur zeigte grüne Zellen mit normaler Größe (Abb. 5II A1–A2). In den Hefezellen, die mit Venetin-1 in einer Konzentration von 50 µg mL−1 inkubiert wurden, waren wiederum kleine rote Flecken sichtbar, was auf das Vorhandensein saurer Vesikel hinweist (gekennzeichnet durch weiße Pfeile) (Abb. 5II B1–B2). Die mit Venetin-1 in einer Konzentration von 100 µg mL−1 behandelten C. albicans-Zellen wiesen eine deutlich größere Anzahl roter Vesikel auf (angezeigt durch weiße Pfeile). Darüber hinaus waren sie größer und intensiver gefärbt als in Zellen, die mit einer geringeren Konzentration an Venetin-1 behandelt wurden (Abb. 5II C1–C4). Der durchschnittliche Prozentsatz an Zellen mit sichtbaren roten autophagischen Körpern betrug 9,44 % in der Kontrollzellkultur und war in den mit Venetin-1 behandelten Proben höher: 16,25 % in der mit der Konzentration von 25 µg mL−1 behandelten Kultur, 33,85 % in der Behandlung mit 50 µg mL−1 und 62,70 % in der Variante mit 100 µg mL−1 (Ergänzende Informationstabelle S2, Abb. S2). Die parametrische Datenverteilung wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test bestätigt (Ergebnisse in der Ergänzungstabelle S2). Homogene Varianzen wurden durch den Levene-Test angezeigt: F (3, 8) = 1,1395; p = 0,313115. Die statistische Signifikanz wurde mit dem Post-hoc-Tukey-HSD-Test und einer einfaktoriellen ANOVA analysiert: F(3, 8) = 423,51; p = 0,000.

Die Ultrastruktur von C. albicans-Zellen nach der Anwendung von Venetin-1 wurde mithilfe der Transmissionselektronenmikroskopie analysiert. Die Kontrollzellen zeichneten sich durch eine regelmäßige Zellwand und eine normale intrazelluläre Struktur mit sichtbaren Organellen aus, d. h. dem Zellkern (N), einer einzelnen Vakuole (V) und Mitochondrien (M), ohne Anzeichen einer Autophagie (Abb. 6A). In den C. albicans-Zellen, die mit Venetin-1 in Konzentrationen von 50 µg mL−1 und 100 µg mL−1 inkubiert wurden, waren wiederum zahlreiche autophagische Vesikel zweier Typen sichtbar. Darüber hinaus hatten die mit dem Komplex behandelten Zellen größere Vakuolen und mehr Mitochondrien als die Kontrollkulturzellen.

TEM-Bildgebung von C. albicans-Zellen: (A) Kontrollzelle; (B1,B2)-Zellen nach Inkubation mit Venetin-1 in einer Konzentration von 50 µg mL−1; (C1,C6) bei einer Konzentration von 100 µg mL−1. V-Vakuole, N-Kern, M-Mitochondrium, rote Pfeile – Autophagosomen; gelbe Pfeile – autophagische Körper. Der Maßstabsbalken entspricht 1 µm.

Die TEM-Technik ermöglichte die Beobachtung mehrerer Schritte des Autophagieprozesses. Im Zellzytoplasma waren reife und vollständig geschlossene Autophagosomen (angezeigt durch rote Pfeile) sichtbar, die ihren Inhalt zur Vakuole transportierten (Abb. 6B1–B2, C1–C6). Anschließend wurden die Stadien der Autophagosomenfusion mit Vakuolen, der Freisetzung des inneren Vesikels in das Vakuolenlumen und der Bildung autophagischer Körper erfasst (Abb. 6B1, C3, C6; autophagische Körper sind durch gelbe Pfeile gekennzeichnet).

Die im Zytoplasma sichtbaren Vesikel waren unterschiedlich groß, was auf das Auftreten verschiedener Arten von Makroautophagie hinweisen kann. Die größeren Autophagosomen sind typisch für die nicht-selektive Makroautophagie, bei der das Vesikel großes Zytoplasma enthält, und die kleineren sind typisch für den selektiven Prozess, bei dem spezifische Strukturen der Hefezelle den Inhalt bilden. Allerdings waren in den C. albicans-Zellen, die mit Venetin-1 in einer Konzentration von 50 µg mL-1 behandelt wurden, alle Autophagievesikel deutlich größer als in den Zellen, die mit Venetin-1 in einer Konzentration von 100 µg mL-1 inkubiert wurden. Die präsentierten Bilder sind repräsentativ für die 30 erhaltenen Bilder.

Das Live/Dead Yeast Viability Kit wird als Standard zur Bestimmung der Stoffwechselaktivität von Pilzzellen verwendet. Die Analyse basiert auf der Fähigkeit von Zellen, den Farbstoff FUN-1 zu verstoffwechseln, wodurch rote Strukturen in Zellvakuolen sichtbar werden. Es wurde in unseren früheren Studien verwendet49. Die Verwendung dieses Kits ermöglichte eine zusätzliche Visualisierung der Mitochondrien (Abb. 7). Die Markierung dieser Organellen war ein unspezifischer Effekt. Die C. albicans-Kontrollkultur zeichnete sich durch metabolisch aktive Zellen mit roten Strukturen innerhalb der Vakuole aus. In den Kontrollzellen waren wiederum keine anderen Strukturen als Vakuolen sichtbar (Abb. 7A1 – A2). Nach der Inkubation der C. albicans-Zellen mit Venetin-1 bei Proteinkonzentrationen von 25, 50, 100 µg mL−1 wurde eine fleckförmige gelbe Fluoreszenz zahlreicher Mitochondrien beobachtet. Diese Organellen waren auf charakteristische Weise angeordnet und bildeten einen Ring unter der Oberfläche der Membran (Abb. 7B1–B2, C1–C2, D1–D2; durch Pfeile angedeutet).

Visualisierung von Mitochondrien in C. albicans- und C. krusei-Zellen nach Färbung mit FUN-1: (A1,A2,E1,E2) Kontrollkulturzellen; (B1,B2,F1,F2)-Zellen nach Inkubation mit Venetin-1 in einer Konzentration von 25 µg mL−1; (C1,C2,G1,G2) in einer Konzentration von 50 µg mL−1; (D1,D2,H1,H2) bei einer Konzentration von 100 µg mL−1. Die Pfeile zeigen Zellen mit gefärbten Mitochondrien. Der Maßstabsbalken entspricht 3 µm.

Um unsere Beobachtungen von Mitochondrien zu bestätigen, wurde ein anderer Candida-Stamm, C. krusei, ebenfalls mit Venetin-1 inkubiert. Der Effekt der mitochondrialen Fluoreszenz nach der Behandlung mit Venetin-1 war in diesem Fall stärker. Die Kontrollzellen zeigten keine gefärbten Mitochondrien (Abb. 7E1–E2). In den mit dem Wirkstoff inkubierten Zellen wiederum waren deutlich gelbgrün fluoreszierende Mitochondrien zu erkennen. Nach der Behandlung von C. krusei-Zellen mit Venetin-1 in einer Konzentration von 25 µg mL−1 waren ihre Mitochondrien klein und als Flecken am Rand der Zellen sichtbar (Abb. 7F1–F2; durch Pfeile angedeutet). Bei Zellen, die mit Venetin-1 in Konzentrationen von 50 und 100 µg mL−1 behandelt wurden, wurden längliche Formen hell fluoreszierender Mitochondrien beobachtet (Abb. 7G1–G2, H1–H2; durch Pfeile angedeutet).

Die Analyse des Venetin-1-Komplexes mittels Kryo-TEM bestätigte die durch die DLS-Analyse ermittelte Nanopartikelgröße25. Die Nanopartikel waren unter dem Mikroskop als kugelförmige Formen sichtbar, die sich manchmal zu Doppelformen zusammenfügten, die in Abb. 8A, B durch rote Pfeile angezeigt sind.

Kryo-TEM-Visualisierung von Venetin-1. Die Nanopartikel sind als kreisförmige dunkle Strukturen sichtbar, die manchmal zu einer Doppelform verschmelzen (angedeutet durch rote Pfeile).

Nach der mit Prometheus Panta durchgeführten Analyse der Venetin-1-Größe (58,23 ± 3,93 nm)25 wurde ein Temperaturschmelzexperiment mit einem Temperaturgradienten von 25 bis 95 °C und einer Heizrampe von 1 °C/min durchgeführt. Wie in Abb. 9 dargestellt, zeigen die Nanopartikel einen einzelnen 350/330-nm-Übergang bei einer Temperatur von 64,95 °C ± 0,08 °C. Dieser Übergang entsprach höchstwahrscheinlich dem Schmelzpunkt der analysierten Nanopartikel. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die analysierten Nanopartikel nach der Konformationsänderung, die durch das Fluoreszenzverhältnis 350/330 nm dargestellt wird, eine Aggregation mit Tagg bei 66,92 ± 0,16 °C und einem Aggregationsbeginn bei 58,97 ± 1,15 °C durchliefen. Interessanterweise zeigte die DLS-Analyse im laufenden Betrieb deutlich eine Zunahme der gesamten Nanopartikelgröße, was zur Bildung größerer 100-nm-Nanopartikel bei einer Temperatur über dem Schmelzpunkt führte (Abb. 9, Tabelle 1).

Prometheus Panta-Schmelzprofil von Venetin-1-Nanopartikeln. Von oben: Panel 1 – Verhältnis 350/330 nm entsprechend den Konformationsänderungen in den Nanopartikeln. Tafel 2 – Erste Ableitung des Verhältnisses 350/330 nm; Tafel 3 – Trübung, die die Aggregation anzeigt; Panel 4 – Größenverteilungsanalyse.

Für jede Lösung wurden fünf Messungen der elektrophoretischen Mobilität, Leitfähigkeit und des Zetapotentials durchgeführt (Tabelle 2) (Abb. 10A, B). Das Zetapotential der getesteten Proben lag in den getesteten pH-Bereichen von 3 bis 12 und verschiedenen Elektrolytkonzentrationen zwischen 10 und – 40 mV. In den meisten getesteten Bereichen sind die ausgewählten Systeme in kolloidaler Form instabil und können delaminieren. Stabile Systeme bei einem absoluten Potential von weniger als –30 mV wurden nur für die folgenden Proben erhalten: V-1/0,0001 M NaCl bei pH = 7, 9, 11; V-1/0,001 M KCl bei pH < 8 (Abb. 10B). Der Vergleich der Ergebnisse für 0,001 mol/dm3 NaCl und 0,001 M KCl ergab sehr unterschiedliche Absolutwerte für pH > 4 bei gleichen Elektrolytkonzentrationen (Abb. 10A,B). Daher wurde festgestellt, dass das Oberflächenpotential von Venetin-1 den größten Einfluss auf das Zetapotential hat.

(A) Abhängigkeit des ζ-Potentials von Venetin-1 von der pH-Funktion in 0,001 M und 0,0001 M NaCl-Lösungen. (B) Abhängigkeit des ζ-Potentials von Venetin-1 von der pH-Funktion in 0,001 M NaCl- und 0,001 M KCl-Lösungen.

Wie in Abb. 10A,B gezeigt, wies das untersuchte System die höchsten Absolutwerte des Zetapotentials bei der niedrigsten Elektrolytkonzentration und die niedrigsten Absolutwerte bei der höchsten Elektrolytkonzentration auf. Es wurde festgestellt, dass das Zetapotential mit zunehmender Elektrolytkonzentration abnahm, was auf die Dissoziation von Oberflächen zurückzuführen ist, die einer Ionisierung auf Venetin-1 ausgesetzt waren. In den untersuchten Systemen nahm das Zetapotential mit steigendem pH-Wert ab. Der Zustand der festen Oberfläche, in dem die Mengen positiver und negativer Ladungen in der diffusen Schicht der elektrischen Doppelschicht (edl) einander gleich sind, wird als isoelektrischer Punkt der festen Oberfläche (IEP – IsoElectric Point) pHIEP bezeichnet. Dann ist die resultierende Ladung der diffusen Schicht der doppelten elektrischen Schicht Null. Da die Konzentration potentiell bildender Ionen (H+ und OH−) vom pH-Wert der Lösung abhängt, entspricht der pHIEP-Punkt einem genau bestimmten pH-Wert. Die pHIEP-Werte von Venetin-1 liegen unter pH 6 für NaCl (Abb. 10A) und pHIEP = 4 für KCl (Abb. 10B). Das bedeutet, dass in einer KCl-Lösung über pH = 4 das Zetapotential positiv und darunter negativ wird, was die elektrostatischen Wechselwirkungen mit anderen Partikeln rund um Venetin-1 beeinflussen kann.

Die inhibitorische Aktivität von Venetin-1 wurde gegen ausgewählte Serinproteasen untersucht, dh zwei Verdauungsenzyme: Trypsin und Chymotrypsin, und drei Transmembranproteasen: Matriptase-1 (MT1), Matriptase-2 (MT2) und Furin. In dieser Studie zeigte Venetin-1 eine moderate Hemmwirkung gegenüber MT1 (IC50-Wert von 176,608 ± 91,164 μg mL−1; Abb. 11A), während die Hemmung von MT2 mit IC50 0,06 ± 0,01 μg mL−1 viel bemerkenswerter war (Abb . 11B). Die Hemmung von Furin war bei der höchsten Konzentration von 250 μg mL−1 marginal und dieses Enzym behielt über 70 % seiner ursprünglichen proteolytischen Aktivität. Aufgrund der engen strukturellen Homologie, aber unterschiedlichen physiologischen Funktionen sind selektive Matriptase-Inhibitoren heutzutage von großem Interesse. Allerdings sind weitere detailliertere Untersuchungen erforderlich, um die Selektivität von Venetin-1 gegenüber MT1 und MT2 eindeutig zu bestimmen, was den Rahmen dieser Arbeit sprengen würde. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die getestete Verbindung Chymotrypsin inhibierte (IC50 1,26 ± 0,14 µg mL−1) und gegenüber Trypsin inaktiv war (Abb. 11C,D).

Proteolytische Aktivität von Matriptase-1 (A) und Matriptase-2 (B), Trypsin (C) und Chymotrypsin (D) nach Behandlung mit Venetin-1 im Vergleich zur Kontrollprobe ohne den Inhibitor.

Ringelwürmer bewohnen Böden, die reich an Mikroorganismen sind, und haben eine einzigartige Fähigkeit entwickelt, in dieser Umgebung zu überleben; Daher stellen sie eine Gruppe von Tieren dar, die von Biologen intensiv untersucht wird, um neue Moleküle mit potenziellen therapeutischen Anwendungen zu finden. Diese wirbellosen Modelltiere sind von entscheidender Bedeutung für die Aufklärung der Mechanismen wichtiger biologischer und entwicklungsbezogener Prozesse in Organismen. Regenwürmer als Modellorganismus sind kostengünstig und vor allem ethisch unumstritten63. Angesichts des Mangels an ausreichender Wirksamkeit und selektiver Wirkung synthetischer Präparate greift die Pharmaindustrie derzeit auf natürliche bioaktive Substanzen zurück, die sich dort als wirksam erweisen könnten, wo die moderne Medizin versagt64.

Venetin-1, das zuvor als Protein-Polysaccharid-Fraktion charakterisiert wurde, zeigte auch eine hemmende Wirkung gegen C. albicans ATCC 10231 und C. krusei ATCC 6258. Venetin-1 störte die Zellteilung und führte zum Zelltod von Pilzen49. Das Präparat verursachte Veränderungen in der Zellwandstruktur des Pilzes und in den nanomechanischen Eigenschaften der Zellwand, wie durch Rasterkraftmikroskopie (AFM)50 nachgewiesen wurde. Bei der Inkubation von C. albicans mit Venetin-1 wanderte mitochondriale DNA in Richtung Kern-DNA. Beide genetischen Materialien vereinigten sich zu einer Kernstruktur, was den Beginn des Apoptoseprozesses darstellte. Es wurde beobachtet, dass die analysierte Verbindung die Expression von Proteinen für oxidativen Stress beeinflusste51. Es wurde gezeigt, dass der Proteinteil des Nanopartikels hauptsächlich aus zwei Lyseninproteinen besteht50. Das Vorhandensein von Kohlenhydratverbindungen im Präparat wurde ebenfalls bestätigt. Die analysierte Verbindung zeigte keine Endotoxizität und Zytotoxizität im Vergleich zu normalen menschlichen Hautfibroblasten49.

In früheren Analysen wurde gezeigt, dass Venetin-1 den Zelltod von C. albicans durch Nekrose und Apoptose verursacht49,51. Im Allgemeinen gibt es drei Haupttypen des Zelltods: Apoptose, Nekrose und Autophagie. Apoptose oder programmierter Zelltod ist ein aktiver Prozess, der die Aktivierung vieler Gene und den Energieaufwand erfordert. Nekrose ist im Gegensatz zur Apoptose ein passiver und pathologischer Prozess. Diese Art des Todes tritt unter dem Einfluss physikalischer, chemischer und biologischer Faktoren nach Überschreiten des Schwellenwerts der Zellimmunität ein. Autophagie ist ein Mechanismus, der als programmierter Zelltod vom Typ II bezeichnet wird65. Dabei werden Proteine ​​mit langer Halbwertszeit und andere Bestandteile von Organellen in Vakuolen geleitet, wo sie abgebaut werden66,67. In der vorliegenden Studie wurde Autophagie während der Analyse der Wirkung von Venetin-1 beobachtet.

Autophagie, ein für eukaryotische Zellen spezifischer Prozess, hat drei Hauptformen: Chaperon-vermittelte Autophagie, Mikroautophagie und Makroautophagie. Makroautophagie ist die häufigste Form und wird aktiviert, um beschädigte Organellen und Proteine ​​abzubauen. Eine kleine Menge Zytoplasma, das beschädigte Strukturen enthält, wird von einem doppelschichtigen Vesikel umhüllt, wodurch ein Autophagosom entsteht, und zur Vakuole transportiert. Die äußere Schicht des Autophagosoms verschmilzt mit der Vakuolenmembran, und die innere Schicht mit ihrem Inhalt gelangt als autophagosomaler Körper in die Vakuole, wo sie durch vakuoläre Enzyme abgebaut wird68,69,70.

Die vorgestellten Fluoreszenzmikroskopie- und Transmissionselektronenmikroskopie-Analysen von Vakuolen zeigten überzeugend den Prozess der Autophagie, also der Verschlingung von Vesikeln nach der Inkubation mit Venetin-1. Die mit Venetin-1 behandelten C. albicans-Zellen hatten deutlich größere Vakuolen als die Kontrollzellen. Diese Veränderungen könnten ihren Ursprung im Autophagieprozess haben, bei dem jedes Autophagosom seine Membran der Vakuolenmembran hinzufügt. Diese zusätzliche Membranaufnahme wird nicht durch den Abfluss ausgeglichen und führt zu einer Vakuolenvergrößerung und einer Verdünnung des intramembranären Inhalts71,72,73,74.

Der Prozess der Autophagie besteht normalerweise darin, die Zelle durch ungünstige Lebensbedingungen zu führen. Autophagie kann eine Strategie für das Überleben der Zellen unter Stressbedingungen wie Hunger, Hypoxie oder dem Einsatz von Chemotherapeutika sein. Der Mechanismus der Autophagie wird aktiviert, um eine zusätzliche Energiequelle zu gewinnen.

Autophagie ist ein wesentlicher Prozess für das Überleben der Zelle, da sie beschädigte oder abnormale Organellen und Moleküle entfernt, die die Zellhomöostase stören können. Nach der Wirkung von Venetin-1 wurde oxidativer Stress beobachtet, der zu Schäden an intrazellulären Strukturen führte. Es gibt Studien, die belegen, dass ROS (reaktive Sauerstoffspezies) eine regulatorische Rolle im Prozess der Autophagie spielen – das Auftreten von ROS aktiviert diesen Prozess. Die Aktivierung des Autophagieprozesses durch ROS zielt darauf ab, ROS-induzierte Schäden zu minimieren75.

Mitochondriale ROS können je nach Konzentration und Standort für Zellen nützlich oder schädlich sein76. Mitophagie, bei der ineffiziente Mitochondrien abgebaut werden, ist eine Art selektive Autophagie. Mitochondrien liefern den größten Teil der von der Zelle benötigten Energie. Die Energieproduktion durch Mitochondrien geht mit der Erzeugung von ROS einher. Eine erhöhte Menge mitochondrialer ROS schädigt Zellbestandteile, einschließlich der Mitochondrien. Dies führt zu verschiedenen pathologischen Veränderungen und hat den Zelltod zur Folge76. Ein wichtiger Prozess für die Zelle ist die Beseitigung überaktiver oder beschädigter Mitochondrien, um die mitochondriale Homöostase aufrechtzuerhalten. Diese Entfernung muss rechtzeitig erfolgen, um keine weiteren Zellschäden zu verursachen77,78.

Nach der Behandlung der C. albicans-Zellen mit Venetin-1 waren diese überaktiven Mitochondrien vergrößert und zeigten im mikroskopischen Bild eine stärkere Fluoreszenz. Darüber hinaus wurde der Stamm C. krusei diesbezüglich analysiert. Es stellte sich heraus, dass sich der Effekt wiederholte und zusätzlich stärker war als bei C. albicans und die Mitochondrien als große, längliche Strukturen am Zellrand sichtbar waren. In unseren früheren Studien wurden vergrößerte Mitochondrien und eine erhöhte Produktion von ROS beobachtet51,52. Es gibt Daten, die belegen, dass mitochondriale Außenmembranproteine ​​in Hefen als Mitophagierezeptoren identifiziert wurden77. Der Bereich der Vakuolen und Mitochondrien ist ein interessantes und immer häufiger diskutiertes Thema bei der Charakterisierung der Hefebiologie. In C. albicans-Zellen ist das Mcp1-Vakuolen- und Mitochondrienpflasterprotein (vCLAMP) an der Aufrechterhaltung der Mitochondrienfunktion und der Mitophagie beteiligt77. Die beobachteten morphologischen und proteomischen Veränderungen in den C. albicans-Zellen nach der Behandlung mit Venetin-151 lassen auf das Auftreten der Mitophagie schließen, die in weiteren Untersuchungen analysiert wird.

SEM-Aufnahmen von C. albicans-Zellen nach Behandlung mit dem Testpräparat wurden in einer früheren Veröffentlichung vorgestellt51. In diesen Studien zeigten wir Zellverformungen und Veränderungen in der Oberfläche der Zellwand, die nach der Einwirkung der analysierten Verbindung unregelmäßig waren. In den aktuellen Studien haben wir eine signifikante Zellvergrößerung nach der Inkubation mit Venetin-1 im Vergleich zu den Kontrollkulturzellen gezeigt, die mit der Autophagie zusammenhängt.

Nach der Wirkung von Venetin-1 wurden zahlreiche Narben nach der Teilung auf der Zelloberfläche beobachtet. Sie ähnelten denen, die in REM-Aufnahmen nach Exposition gegenüber Fluconazol beobachtet wurden, einem bekannten Medikament, das die Struktur der Zellmembran von C. albicans zerstört79. Unserer Meinung nach kommt die Zelle, die sich in kurzer Zeit viele Male teilt, nicht mit der Produktion von Baustoffen Schritt, die für die Synthese der Strukturen der Zellwand anstelle von Narben erforderlich sind. Darüber hinaus kommt es zu Störungen im Zellinneren, deren Hemmung mit dem Aufwenden von Zellenergie verbunden ist, um die Zelle am Leben zu erhalten.

Als Fortsetzung der multidirektionalen Charakterisierung des Venetin-1-Nanopartikels beschlossen wir, das Zeta-Potenzial für diesen Komplex zu analysieren. Ein wichtiges Quantum der in der Flüssigkeit dispergierten Partikel ist ihre Stabilität, dh die Fähigkeit der Partikel, in Form einer kolloidalen Dispersion zu bleiben. Bei instabilen Dispersionen kann es zu Koagulations- oder Sedimentationsprozessen kommen, die zur Delamination der Probe führen. Das Zetapotential ist das Potential, das in der Doppelschicht an der Oberfläche dispergierter Partikel auftritt. Es handelt sich um ein Potential zwischen dem Dispergiermittel und der Flüssigkeitsschicht, die an der Oberfläche des Partikels haftet. Dieser Parameter wird zur Bestimmung der Stabilität kolloidaler Systeme verwendet. Es wird angenommen, dass die Dispersion für einen Absolutwert der Zetapotentiale >|± 30| stabil ist V. Diese Bedingungen wurden von einigen der analysierten Proben erfüllt. Das Zetapotential von Venetin-1 hängt vom Oberflächenpotential ab. Das Zetapotential wurde im pH-Bereich von 3 bis 7 im 0,001 M NaCl-Elektrolyten und im pH-Bereich von 3 bis 8 in 0,001 M KCl gemessen. Die getesteten Systeme waren instabil und aggregierten, was durch Partikelgrößenmessungen mit der Methode der dynamischen Lichtstreuung bestätigt wurde.

Die vorliegende Studie zeigte, dass Venetin-1 zusätzlich eine inhibitorische Aktivität gegenüber bestimmten proteolytischen Enzymen aufweist, nämlich Matriptase-1 (MT1), Matriptase-2 (MT2) und Chymotrypsin. Beide Matriptasen sind Transmembran-Serinproteasen vom Typ II, weisen eine Trypsin-ähnliche Spezifität auf und weisen eine hohe strukturelle Ähnlichkeit auf, unterscheiden sich jedoch in der biologischen Aktivität80. MT1 beeinflusst die Bildung und Integrität von Epithelgewebe und ist an verschiedenen epithelialen Krebsarten beteiligt, darunter Brust-, Prostata- und Eierstocktumoren81. Bemerkenswert ist, dass seine erhöhte Aktivität oft als prädiktiver Faktor für eine schlechte Krebsprognose angesehen wird82. MT2 fungiert als proteolytischer Regulator bei der menschlichen Eisenhomöostase. Mutationen in seinem Gen TMPRSS6 korrelieren mit eisenrefraktärer Eisenmangelanämie, während seine hochregulierte Aktivität zu Eisenüberladungsstörungen führen kann83. Die inhibitorische Aktivität von Venetin-1 gegen Furin, dh eine Transmembran-Serinprotease vom Typ I, die an der Spaltung vieler inaktiver Proteinvorläufer im konstitutiven Sekretionsweg beteiligt ist, war unbedeutend84.

Darüber hinaus zeigten die Analysen, dass Venetin-1 Chymotrypsin stark hemmte und gegenüber Trypsin inaktiv war. Bei beiden proteolytischen Enzymen handelt es sich um pankreatische Serinproteasen, die an der Nahrungsverdauung beteiligt sind und unterschiedliche Substratpräferenzen aufweisen. Trypsin hydrolysiert spezifisch Peptidbindungen nach basischen Aminosäureresten wie Lys und Arg, während Chymotrypsin Peptidbindungen spaltet, die durch die Carboxylgruppen von aromatischen Tyr-, Phe- und Trp- oder aliphatischen Leu-Resten gebildet werden.

Die Hemmung der proteolytischen Aktivität ist ein sehr wichtiger molekularer Mechanismus, durch den Organismen Selbstverletzungen85 verhindern und sich vor Krankheitserregern86,87,88,89 oder Raubtieren90,91,92 schützen. Von allen Arten von Proteaseinhibitoren sind Serinproteaseinhibitoren (SPIs) die häufigsten93. Sie sind bei Wirbellosen weit verbreitet, z. B. bei Kuruma-Garnelen (Marsupenaeus japonicas), Schwarzen Tigergarnelen (Penaeus monodon)92, Seeanemonen94,95, Skorpionen93,95,96, Hakenwürmern97 und zahlreichen giftigen Tieren – Spinnen und Schnecken93,98,99. SPIs mit antimykotischer Wirkung wurden bei der Seidenraupe (Bombyx mori)100 beschrieben. Von Lee berichtete Studien92,101 zeigten auch, dass von der Auster Crassostrea gigas produzierte SPIs eine Aktivität gegen das HIV-1-Virus aufweisen. Andererseits wurde berichtet, dass HIV-Proteaseinhibitoren nachweislich die Zelladhäsion von C. albicans verringern, indem sie von Hefen sezernierte Asparaginproteasen hemmen102,103. Die Inzidenz von Candidiasis bei HIV-infizierten Patienten ist nachweislich deutlich reduziert104.

Die pharmazeutische Industrie bietet mehrere Proteaseinhibitoren an, die bei der Behandlung menschlicher Krankheiten eingesetzt werden, wie etwa Dabigatran zur Behandlung von Lungenembolien und Angiotensin-Converting-Enzym-Inhibitoren (ACEI) zur Behandlung von Bluthochdruck92,105,106. Die American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD) empfiehlt eine Therapie für das chronische Hepatitis-C-Virus (HCV) des Genotyps 1 auf Basis von Serinproteaseinhibitoren zusammen mit pegyliertem Interferon α und Ribavirin107. Der Proteasom-Inhibitor Bortezomib mit antimykotischer Wirkung108,109 wurde für die klinische Behandlung des multiplen Myeloms zugelassen110. Es ähnelt dem Venetin-1-Nanopartikel, das das 20S-Proteasom hemmt und gleichzeitig antimykotische Aktivität zeigt.

Die Entdeckung von Proteaseinhibitoren aus der natürlichen Umgebung könnte Vorteile gegenüber der Entwicklung synthetischer Verbindungen mit solchen Eigenschaften haben. Es sind bekannte natürliche Inhibitoren bekannt, deren Wirkungsmechanismus dem von Venetin-1 ähnelt, d oxidativer Stress und Zelltod durch Apoptose111,112,113. Natürliche Proteaseinhibitoren überwinden Resistenzmechanismen leichter und sind stabiler und weniger toxisch. Diese Argumente untermauern die Zweckmäßigkeit der Suche nach diesen Verbindungen in der Natur92.

Die antimykotische Wirkung von Regenwurm-CF wurde hauptsächlich im Zusammenhang mit Pilzen beschrieben, die Pflanzen befallen8,22,114. Wenn CF gegen Pflanzenpathogene eingesetzt wird, ist die Zytotoxizität der Flüssigkeit unerheblich und es kann in seiner Rohform verwendet werden. Um jedoch gegen Pilzinfektionen beim Menschen eingesetzt zu werden, muss das CF-Präparat richtig zubereitet werden, damit es keine Zytotoxizität oder Endotoxizität zeigt. Da unsere Forschung darauf abzielt, Venetin-1 als Chemotherapeutikum zu verwenden, musste es viele Laborprozesse durchlaufen, um die erforderlichen Bedingungen zu erfüllen. Unter Berücksichtigung der Eigenschaften und der multidirektionalen antimykotischen und krebsbekämpfenden Wirkung von Venetin-1 und seiner komplexen Struktur scheint die strukturelle Verbindung von Polysacchariden und Lyseninen ein interessantes Forschungsthema zu sein, das mit Techniken aus verschiedenen wissenschaftlichen Disziplinen erforscht werden kann.

Zusammenfassend zeigten die durchgeführten Analysen, dass die Abnahme des Überlebens von C. albicans-Zellen mit Veränderungen in der Morphologie der Zellen und Zellorganellen wie Vakuolen und Mitochondrien einherging. Es wurden für Autophagie typische Vakuolenveränderungen und eine Vergrößerung der Mitochondrien beobachtet. Das Zetapotential des getesteten Präparats wurde charakterisiert. Die Aggregationsfähigkeit und die Eigenschaften des Proteaseinhibitortyps des Venetin-1-Nanopartikels wurden nachgewiesen. Die Verbindung, die hemmende Wirkungen gegen bestimmte Serinproteasen und das 20S-Proteasom aufweist, scheint ein vielversprechendes Chemotherapeutikum zur Bekämpfung von C. albicans-Infektionen bei Menschen und Tieren zu sein.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die vorgestellten Forschungsergebnisse wurden vom Projekt des Nationalen Wissenschaftszentrums Polen [2020/37/B/NZ7/00763] unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Sylwia Wójcik-Mieszawska und Kinga Lewtak.

Abteilung für Immunbiologie, Institut für Biowissenschaften, Fakultät für Biologie und Biotechnologie, Maria-Curie-Skłodowska-Universität, Lublin, Polen

Sylwia Wójcik-Mieszawska & Marta J. Fiołka

Abteilung für Zellbiologie, Institut für Biowissenschaften, Fakultät für Biologie und Biotechnologie, Maria-Curie-Skłodowska-Universität, Lublin, Polen

Kinga Lewtak

Abteilung für Radiochemie und Umweltchemie, Institut für Chemische Wissenschaften, Fakultät für Chemie, Maria-Curie-Skłodowska-Universität, Lublin, Polen

Ewa Skwarek

Abteilung für Molekulare Biochemie, Fakultät für Chemie, Universität Danzig, Danzig, Polen

Dawid Dębowski & Agata Gitlin-Domagalska

Malopolska Center of Biotechnology, Jagiellonen-Universität, Krakau, Polen

Jakub Nowak

Abteilung für funktionelle Anatomie und Zytobiologie, Institut für Biowissenschaften, Maria-Curie-Skłodowska-Universität, Lublin, Polen

Jerzy Wydrych & Jarosław Pawelec

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SWM und MJF und KL haben den Hauptmanuskripttext geschrieben; SWM und MJF bereiteten Venetin-1 für Forschungszwecke vor; Feigen. 5, 6; SWM erstellte Durchflusszytometrie, SEM-Analyse, TEM-Analyse, Fluoreszenzmikroskopie-Analyse und statistische Analyse, erstellte Abb. 2 und ergänzende Informationen; MF erstellte das Konzept des Manuskripts, bereitete Kryo-REM-, Kryo-TEM-, TEM- und Fluoreszenzmikroskopieanalysen vor und bereitete die Abbildungen vor. 1, 2, 4, 7, 8; ES erstellte eine Zetapotentialanalyse und Abb. 10 und Tabelle 2; KL vorbereitet Abb. 5, 7; DD und AGD führten eine Analyse der Hemmwirkung durch und erstellten Abb. 11; JN führte eine Prometeus-Panta-Analyse durch und Abb. 9 und Tabelle 1; JW führte eine mikroskopische Analyse durch; JP führte eine TEM-Analyse durch. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Kinga Lewtak oder Marta J. Fiołka.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wójcik-Mieszawska, S., Lewtak, K., Skwarek, E. et al. Autophagie von Candida albicans-Zellen nach Einwirkung des Regenwurm-Venetin-1-Nanopartikels mit Proteaseinhibitoraktivität. Sci Rep 13, 14228 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41281-4

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Eingegangen: 02. März 2023

Angenommen: 24. August 2023

Veröffentlicht: 30. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41281-4

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