Blog

Jul 26, 2023

Effizienzskala für die Streuung lumineszierender Partikel in Verbindung mit grundlegenden und messbaren spektroskopischen Eigenschaften

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 6254 (2023) Diesen Artikel zitieren 547 Zugriffe auf Metrikdetails Vergleich der Leistung von molekularen und nanoskaligen Luminophoren und lumineszierenden Mikro- und

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 6254 (2023) Diesen Artikel zitieren

547 Zugriffe

Details zu den Metriken

Der Vergleich der Leistung von molekularen und nanoskaligen Luminophoren und lumineszierenden Mikro- und Nanopartikeln sowie die Abschätzung erreichbarer Signalamplituden und Nachweisgrenzen erfordert eine standardisierbare Intensitätsskala. Dies leitete die Entwicklung der relativen MESF- (Anzahl der Moleküle äquivalenter löslicher Fluorochrome) und ERF-Skalen (äquivalente Referenzfluorophore) für die Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie ein. Beide Intensitätsskalen basieren auf Fluoreszenzintensitätswerten, die fluoreszierenden Kalibrierungskügelchen durch einen Intensitätsvergleich mit spektral gut passenden Fluorophorlösungen bekannter Konzentration mithilfe eines Spektrofluorometers zugewiesen wurden. Alternativ kann die Luminophor- oder Perlenhelligkeit (B) bestimmt werden, die dem Produkt aus dem Absorptionsquerschnitt (σa) bei der Anregungswellenlänge (σa(λex)) und der Photolumineszenzquantenausbeute (Φpl) entspricht. Dadurch kann eine absolute Skala basierend auf grundlegenden und messbaren spektroskopischen Eigenschaften realisiert werden, die unabhängig von Partikelgröße, Material und Luminophor-Färbung oder Markierungsdichte ist und die Empfindlichkeit der optischen Eigenschaften von Luminophoren gegenüber ihrer Umgebung berücksichtigt. Mit dem Ziel, eine solche Helligkeitsskala für lichtstreuende Dispersionen lumineszierender Partikel mit Größen von mehr als einigen zehn Nanometern zu erstellen, zeigen wir, wie die Helligkeit von quasi-monodispersen 25 nm, 100 nm und 1 µm großen Polystyrolpartikeln (PSP), beladen mit zwei verschiedene Farbstoffe in unterschiedlichen Konzentrationen können mit einem einzigen speziell entwickelten Ulbrichtkugel-Aufbau erhalten werden, der die absolute Bestimmung von Φpl ​​sowie Transmissions- und diffuse Reflexionsmessungen ermöglicht. Die resultierenden Φpl, σa(λex), Imaginärteile des Brechungsindex und berechneten B-Werte dieser Proben werden in Abhängigkeit von der Anzahl der eingebauten Farbstoffmoleküle pro Partikel angegeben. Abschließend wird eine einheitenlose Lumineszenzeffizienz (LE) definiert, die den direkten Vergleich der Lumineszenzeffizienz von Partikeln unterschiedlicher Größe ermöglicht.

In den letzten Jahrzehnten wurden Nanopartikel (NPs) und Mikropartikel (MPs), die mit verschiedenen Arten von molekularen und nanokristallinen Luminophoren gefärbt oder kodiert wurden, zunehmend in den Lebens- und Materialwissenschaften eingesetzt. Typische Anwendungen reichen von optischen Reportern für Fluoreszenztests und Bioimaging- und Arzneimittelabgabesysteme über druckbare Authentifizierungsetiketten und Bead-basierte Plattformen für Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie und Immunseparation bis hin zu Partikelsensoren und Kalibrierungswerkzeugen für verschiedene Fluoreszenzmethoden, insbesondere für die Durchflusszytometrie1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Die meisten Fluoreszenzmethoden, die emittierende NPs und MPs nutzen, wie Fluoreszenzspektroskopie, Mikrofluormetrie, Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie, messen nur gerätespezifische relative Fluoreszenzintensitäten14. Der zuverlässige Vergleich von Fluoreszenzmessungen zwischen verschiedenen Instrumenten und verschiedenen Labors erfordert eine Instrumentenkalibrierung, um instrumentenspezifische Signalbeiträge wie die wellenlängenabhängige spektrale Empfindlichkeit des Detektionskanals des Instruments zu bestimmen und zu berücksichtigen, die sich auf die gemessenen Emissionsspektren auswirken15,16. Für die Quantifizierung von z. B. Analyten oder den Vergleich verschiedener fluoreszierender Proben mit unterschiedlichen Fluoreszenztechniken wird üblicherweise eine relative Kalibrierung der Fluoreszenzintensitätsskala unter Verwendung von Fluorophorlösungen mit bekannten Konzentrationen, Lumineszenzeigenschaften und insbesondere Emissionsspektren durchgeführt, die denen der Fluoreszenzspektren weitgehend entsprechen Probe unter Verwendung derselben Geräteeinstellungen, die für die Messung der Probe angewendet wurden17. Dies ist für transparente lumineszierende Proben, z. B. Sensoranwendungen oder die Quantifizierung von Luminophoren mit chromatographischen Trenntechniken wie Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Fluoreszenzdetektion, einfach, für lichtstreuende Systeme jedoch eine Herausforderung. Allerdings streuen die meisten Dispersionen weit verbreiteter fluoreszierender NPs und MPs das Anregungslicht, abhängig von ihrer Größe sowie dem Brechungsindex und der Umgebung der Partikel. Dies kann sich auf ihre fluorometrische Charakterisierung und insbesondere auf die Messung ihrer Absorptionseigenschaften mit gängigen Spektrophotometern und Spektrofluorometern auswirken, die für die Messung transparenter Proben konzipiert sind.

Die Bedeutung der Quantifizierung streuender lumineszierender Objekte, beispielsweise für die Durchflusszytometrie zur Blut-, Zell- und Biomarkeranalyse in stark regulierten Bereichen wie dem Gesundheitssektor und der medizinischen Diagnostik, erforderte die Einführung einer vergleichbaren und standardisierbaren Fluoreszenzintensitätsskala18. Dies leitete die Entwicklung der sogenannten relativen MESF- (Anzahl der Moleküle äquivalenter löslicher Fluorochrome)19,20 und ERF-Skalen (äquivalente Referenzfluorophore)11 zur Messung und Quantifizierung der Fluoreszenzintensität fluoreszierender Objekte in der Durchflusszytometrie mithilfe von Lumineszenzmitteln ein Kalibrierungsperlen21. Dieses Konzept wird auch in der Fluoreszenzmikroskopie genutzt. Die MESF- und ERF-Skala basiert auf dem Vergleich der integralen Fluoreszenzintensitäten einer Dispersion farbstoffgefärbter Partikel mit einer engen Größenverteilung bekannter Konzentration mit einer Lösung eines molekularen Fluorophors bekannter Konzentration mit einem genau passenden Emissionsspektrum. Dabei wird die Fluoreszenzintensität der Perlen durch die Intensität dieses molekularen Fluorophors und die quantitative Bestimmung der spektroskopischen Schlüsselparameter Absorptionsquerschnitt (σa(λ)) und Photolumineszenz bzw. Fluoreszenzquantenausbeute (Φpl) des Farbstoffs ausgedrückt. fleckige Perlen werden umgangen. Diese relativen Intensitätskalibrierungskonzepte haben inzwischen zur breiten Verfügbarkeit einer Vielzahl von Kalibrierungsperlen mit zugewiesenen MESF- oder ERF-Werten geführt, die an die optischen Eigenschaften typischer Fluoreszenzmarkierungen in der Durchflusszytometrie angepasst sind. Darüber hinaus wurde die Zuverlässigkeit und Genauigkeit dieser Konzepte in den letzten Jahrzehnten durch mehrere Ringversuche von Expertengruppen und verschiedenen Durchflusszytometern für verschiedene Arten von kerngefärbten oder mit Fluorophor markierten Kalibrierungskügelchen bewertet. Dabei wurden Einschränkungen untersucht, die beispielsweise durch die mikroumgebungs- und farbstoffkonzentrationsabhängige Fluoreszenzeffizienz der meisten Fluorophore und verschiedene Instrumentendesigns einschließlich optischer Komponenten für Durchflusszytometer verursacht werden22,23,24,25,26.

Alternativ zu einer relativen Fluoreszenzintensitätsskala kann eine absolute Skala basierend auf den grundlegenden spektroskopischen Eigenschaften σa(λex) und Φpl21,27, dem Verhältnis der Anzahl emittierter Photonen zur Anzahl absorbierter Photonen28, realisiert und zur Quantifizierung verwendet werden. z. B. in Bildgebungsstudien29. Das Produkt dieser beiden Größen wird als Helligkeit (B) bezeichnet und steuert die Größe jedes fluormetrisch erfassten Signals von der Probenseite. Dieses Konzept wurde für einzelne Moleküle30 vorgeschlagen, jedoch nicht für lichtstreuende Dispersionen lumineszierender Partikel, da die Lichtstreuung die Bestimmung von σa(λex) und Φpl schwieriger macht und spezielle Instrumente erfordert. σa(λex) von Partikeldispersionen kann aus der Strahlungstransporttheorie abgeleitet werden, indem ein Spektrophotometer mit einer Ulbrichtkugel zur Messung der wellenlängenabhängigen Transmission und des diffusen Reflexionsgrads (Rd) verwendet wird. Φpl von lichtstreuenden Lumineszenzproben kann optisch nur durch Ulbrichtkugelspektroskopie genau bestimmt werden27,31 und das zunehmende Interesse an solchen Messungen löste im letzten Jahrzehnt eine Renaissance der Ulbrichtkugelspektroskopie aus32,33,34,35,36,37. Für Partikel mit Größen unter 100 nm, bei denen die Streuung mehr oder weniger isotrop ist, gibt es auch nur sehr wenige Berichte über alternative relative spektroskopische Methoden, die allerdings aufwändiger und fehleranfälliger sind. Dazu gehören eine auf Subtraktion basierende Streukorrektur der gemessenen Absorption bei der Anregungswellenlänge38, die Hinzufügung von Streuern zum Fluoreszenzquantenausbeutestandard, der für die relative Bestimmung von Φpl ​​verwendet wird, wodurch die Streumerkmale von Probe und Standard angepasst werden39, und die Bestimmung der komplexe dielektrische Funktion farbstoffbeladener Partikel und Berücksichtigung des Einflusses der Mie-Streuung40.

Mit dem Ziel, eine B-Skala zur Charakterisierung der signalrelevanten Eigenschaften lumineszierender Perlen zu etablieren, zeigen wir im Folgenden, wie B von lichtstreuenden Dispersionen lumineszierender Partikel mit einem einzigen maßgeschneiderten und rückverfolgbar kalibrierten Ulbrichtkugel-Aufbau erhalten werden kann . Dieser einzigartige Aufbau ermöglicht sowohl die absolute Bestimmung von Φpl-Werten als auch Messungen von Rd, kollimierten Transmissionsspektren (Tc) und diffusen Transmissionsspektren (Td) von Partikeldispersionen27. Die Bestimmung der B-Werte wird für Dispersionen monodisperser Polystyrolpartikel (PSP) mit einer Größe von 100 nm und 1 µm demonstriert, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Nilrot- und Itrybe-Molekülen beladen sind und deren solvatochromes Verhalten und spektrale Überlappung zwischen ihren Absorptions- und Emissionsbanden variieren (Stokes-Verschiebung) und damit konzentrationsabhängige Reabsorption41. Nilrot ist eine häufig verwendete Polaritätssonde42,43 und mit Itrybe und Nilrot beladene Polystyrolpartikel wurden von uns zuvor für Farbstoffbeladungsstudien41,42 und als tumorspezifische NIR-Sonde44 oder die lebensdauerbasierte Kodierung von Zellen45 verwendet. In dieser Veröffentlichung bewerten wir zuvor bestimmte B-Werte solcher farbstoffgefärbten Perlen42 neu und geben den Imaginärteil des Brechungsindex an. Darüber hinaus werden B- und Effizienzwerte aus gemessenen σa(λex)- und Φpl-Daten in Abhängigkeit von der Anzahl der eingebauten Farbstoffmoleküle pro Partikel angegeben.

Die experimentellen Verfahren, die für die Farbstofffärbung des unterschiedlich großen Carboxyl-funktionalisierten PSP und die absolute Bestimmung der Φpl-Werte mit unserem maßgeschneiderten Ulbrichtkugel-Aufbau verwendet wurden und Messungen der Fluoreszenz-, Rd-, Tc- und Td-Spektren von Partikelsuspensionen ermöglichten, wurden teilweise durchgeführt zuvor berichtet27,31,41,42,44,46.

Carboxyl-funktionalisiertes PSP mit Größen von 25 nm, 100 nm und 1 µm wurde von der Kisker Biotech GmbH bezogen. Alle Partikel wurden vor der Verwendung mit Ultraschall behandelt. Nile Red und Itrybe wurden von Fluka GmbH bzw. Otava Ltd bezogen. Die Lösungsmittel Tetrahydrofuran (THF), Dibutylether (BOB) und Ethanol (EtOH) waren von spektroskopischer Qualität und wurden von Merck bezogen. Alle Farbstoffe und Lösungsmittel wurden wie erhalten verwendet.

Für spektral aufgelöste Messungen im Wellenlängenbereich von etwa 350 bis 1000 nm wurde ein speziell entwickelter und rückführbar kalibrierter Ulbrichtkugel-Aufbau verwendet, der die freie Wahl der Anregungswellenlänge ermöglicht27. Dieser zuvor beschriebene Aufbau31,46 bestand aus einer 450-W-Xenonlampe, gekoppelt mit einem einzelnen Monochromator mit 1200-L/mm-Gittern, die bei 330 nm, 500 nm und 630 nm beleuchtet wurden, und einer Ulbrichtkugel mit einem Durchmesser von etwa 15 cm, beschichtet mit Spectraflect (Labsphere GmbH; Kugelreflexionsgrad ca. 97 % im Vis/NIR) als Probenraum. Die Ulbrichtkugel wurde mit einem Quarzfaserbündel an einen bildgebenden Spektrographen (Shamrock 303i, Andor Technology PLC) gekoppelt, der mit 600-L/mm-Gittern ausgestattet war, bei 500 nm und 750 nm gestrahlt wurde und an einem Peltier-gekühlten (183 K) verdünnten Gerät befestigt war Rückseite beleuchtetes ladungsgekoppeltes Deep Depletion Device (CCD-Array; 1024 × 256 Pixel). Um die Erfassung ausschließlich diffuser Strahlung zu gewährleisten, wurde die Lichtleitfaser durch mehrere Blenden vor direkten Reflexen geschützt. Um seine Schwankungen und die Messungen der kollimierten Transmission zu berücksichtigen, wurden zwei Peltier-gekühlte, speziell entwickelte Siliziumfallendetektoren47 in den Ulbrichtkugel-Aufbau implementiert.

Um mehrere Messkonfigurationen bzw. Beleuchtungsbedingungen für die spektral aufgelösten Messungen der Emission, Reflexion und Transmission sowie eine indirekte Probenbeleuchtung zu realisieren, wurde die Ulbrichtkugel mit mehreren Ports zur Lichteinkopplung in die Kugel und Probenhalterung ausgestattet. Zur absoluten Bestimmung von Φpl ​​wurde die Probe mithilfe eines speziell entwickelten, mit Spectraflect beschichteten Küvettenhalters in der Mitte der Ulbrichtkugel befestigt. Das Anregungslicht wurde mit zwei außeraxialen Parabolspiegeln in die Mitte (Probenposition) der Ulbrichtkugel fokussiert, wodurch der Austrittsspalt des Anregungsmonochromators auf die Mitte der Küvette abgebildet wurde (siehe ergänzende Abbildung S1)31. Die Strahlungsleistung, die die Probe erreicht, wurde mit einer Blende vor der Ulbrichtkugel eingestellt. Für die präzise Positionierung der Zellen innerhalb der Ulbrichtkugel wurde zusätzlich zum Küvettenhalter ein kleiner HeNe-Laser verwendet. Das von der Glas/Luft-Grenzfläche des Küvettenfensters reflektierte Laserlicht wurde außerhalb der Ulbrichtkugel gemessen.

Für Transmissions- und Reflexionsmessungen ist ein kollimierter Strahl erforderlich. Daher wurde der Aufbau der Ulbrichtkugel leicht modifiziert. Der parabolische Off-Axis-Spiegel 2 (siehe Ergänzende Informationen (SI), Abb. S1) wurde durch einen Planspiegel ersetzt. Dabei konnte die Spotgröße für Reflexions- und Transmissionsmessungen mit Blenden hinter dem geöffneten Austrittsspalt des Anregungsmonochromators eingestellt werden. Maßgeschneiderte Probenhalter für dünne Filme und Zellen mit kleinem Volumen wurden vor oder hinter der Ulbrichtkugel platziert. Die Zellen wurden so entworfen, dass sie genau in die Öffnungen der Ulbrichtkugel passen. Die typische Probendicke für Transmissions- und Reflexionsmessungen lag zwischen 200 µm und 1 mm bei einem Durchmesser von 2,54 cm.

Die Absorptionsspektren transparenter Lösungen der Farbstoffe Nilrot und der aus dem mit Farbstoff gefärbten PSP bei Zugabe von THF freigesetzten Farbstoffe wurden mit dem UV-Vis-NIR-Spektrophotometer Cary5000 unter Verwendung von 1-cm-Quarzzellen von Hellma gemessen.

Dynamische Lichtstreuungsmessungen zur Partikelgrößenbestimmung wurden mit dem Zetasizer von Malvern durchgeführt.

Kommerzielles carboxyliertes PSP wurde mit Nile Red und Itrybe über ein zuvor beschriebenes Quellverfahren gefärbt27,41,42. Kurz gesagt, Nilrot und Itrybe wurden in THF in Konzentrationen von 0,1 bis 5 mmol/L gelöst. 100 µL der farbstoffhaltigen Lösung wurden zu 600 µL einer wässrigen PSP-Suspension (3 mg/ml) gegeben. 25 nm PSP wurden 30 Minuten lang inkubiert, wohingegen 100 nm und 1 µm PSP 1 Stunde lang inkubiert wurden. Dann wurden 800 µL Wasser zugegeben und die Suspension zentrifugiert (1 µm PSP (5.000 g, 10 Min.) und 100 nm PSP (15.000 g, 40 Min.) in einer Eppendorf-Zentrifuge 5415D, 25 nm PSP (75.000 g, 45 Min.). ) in einer Beckman Coulter-Zentrifuge Avanti J-20 XP. Die gefärbten PSP wurden zweimal gewaschen und in bidestilliertem Wasser resuspendiert.

Die Anzahl der eingebauten Farbstoffmoleküle pro Partikel wurde nach Auflösen der Partikel durch Zugabe von THF48 photometrisch bestimmt. Kurz gesagt, die gefärbten PSPs wurden zentrifugiert, der Überstand entfernt und in THF gelöst. Die aus 3 mg PSP freigesetzte Farbstoffkonzentration wurde aus Absorptionsmessungen berechnet und der molare Absorptionskoeffizient wurde in THF in Gegenwart von 0,1 Gew.-% gelöstem Polystyrol bestimmt. Die Polystyrol-Massenkonzentration wurde durch Trocknen und Wiegen von 1 ml der wässrigen Suspension bestimmt und die Anzahl an PSP pro mg wurde unter Berücksichtigung des Partikelvolumens und der PS-Dichte (1050 kg/m3) bestimmt.

Unser Verfahren zur Datenerfassung zur Partikelhelligkeits- und Effizienzbestimmung auf Basis der Ulbrichtkugel-Spektroskopie folgt der schematischen Darstellung in Abb. 1. Zur Bestimmung der Φpl-Werte werden die absorbierten (\({q}_{\mathrm{p}}^ {\mathrm{abs}}\)) und der emittierte Photonenfluss (\({q}_{p}^{pl}\)) werden bestimmt (siehe Abschnitt „Bestimmung der Photolumineszenz-Quantenausbeuten“). Im nächsten Schritt wurden Reflexions- und Transmissionsmessungen durchgeführt (siehe Abschnitt „Reflexions- und Transmissionsmessungen“), die Rd, Tt, Td und Tc ergaben. Mit diesen experimentell ermittelten Parametern kann Φpl ​​direkt berechnet werden (siehe Abschnitt „Bestimmung der Photolumineszenz-Quantenausbeuten“). Durch Lösung der Strahlungstransporttheorie können die Streuung (µs), die Absorptionskoeffizienten (µa) und der Streuanisotropiefaktor (g) berechnet werden (siehe Abschnitt zur Berechnung von µa, µs und g). Durch die Umsetzung der Mie-Theorie werden auch die Anzahl der Partikel pro Volumeneinheit (NP), der Partikelradius (rP) und der Imaginärteil des Brechungsindex (n2) bestimmt (Abschnitt „Bestimmung der Partikeleigenschaften“). Die resultierenden σa(λex)- und Φpl-Werte werden schließlich für die Berechnung von B und der Lumineszenzeffizienz (LE) verwendet.

Flussdiagramm der Datenerfassung und -analyse: absorbierter (\({q}_{\mathrm{p}}^{\mathrm{abs}}\)) und emittierter Photonenfluss (\({q}_{p}^{ pl}\)). Diffuse Reflexion (Rd), Gesamttransmission (Tt), diffuse (Td) und kollimierte Transmission (Tc), Streukoeffizienten (µs), Absorptionskoeffizienten (µa), Streuanisotropiefaktor (g), Fluoreszenzquantenausbeute (Φpl), Anzahl Anzahl der Partikel pro Volumeneinheit (NP), Partikelradius (rP), Imaginärteil des Brechungsindex (n2), Absorptionsquerschnitt (σa), Absorptionseffizienz (Qabs) und Partikellumineszenzeffizienz (LE).

Die optische Reaktion einer Ulbrichtkugel hängt von ihrer Konfiguration ab (Probenhalter, Schallwand, Öffnungsgrößen usw.). Für eine ideale Kugel ist der Vergrößerungsfaktor M(λ) gegeben durch49:

\(\overline{\rho } (\lambda )\) stellt die mittlere wellenlängenabhängige Reflektivität der Kugeloberfläche dar, die von den Anschlussflächen Ai mit ihren entsprechenden Reflektivitäten \(\rho_{i} (\lambda )\) und abhängt die Oberfläche der Kugel AS bzw. das Reflexionsvermögen ρS(λ) (fi = Ai/AS). Der einfallende Strahlungsfluss ϕe wird von einem Oberflächenbereich mit einem Reflexionsgrad ρ0(λ) diffus reflektiert (siehe Gleichung 1, Abb. 2). Der resultierende Strahlungsfluss ϕS, der die Kugeloberfläche erreicht und das Detektorsignal I erzeugt, hängt von ϕe und M(λ) ab:

Konfigurationen des Ulbrichtkugel-Aufbaus, siehe auch ergänzende Abbildung S1, und die entsprechenden Lichtflüsse (Gleichung S3), die für (a) \({\Phi }_{pl}\)-Messungen, (b) Rd-Messungen und verwendet werden (c, d) die Messung von Tt, Td und Tc.

Unter weiterer Berücksichtigung der Detektoroberfläche AD und der spektralen Empfindlichkeit des Detektionssystems s(λ) kann ich wie folgt geschrieben werden:

Somit verändert jede Änderung der Konfiguration der Ulbrichtkugel (siehe auch Abb. 2) oder der Oberfläche, z. B. der Austausch einer Probe und einer Referenz, die Reaktion des Ulbrichtkugel-Aufbaus und muss berücksichtigt werden.

Die Quantenausbeute der Photolumineszenz ist definiert als der Quotient aus der Anzahl der absorbierten Photonen (Nabs) und der Anzahl der emittierten Photonen (Nem) einer Probe27,42,46,50, siehe Gl. (4).

\({\Phi }_{pl}\) von Streuproben wie den Suspensionen unseres farbstoffgefärbten PSP kann nur durch Ulbrichtkugelspektroskopie zuverlässig bestimmt werden51. Dazu gehört die Bestimmung des absorbierten Photonenflusses (\({q}_{p}^{abs}({\lambda }_{\text{ex}})\)) und des emittierten Photonenflusses (\({q }_{p}^{em}({\lambda }_{\text{em}})\)) der Probe (siehe Gleichung (5) und Abb. 2a))31,46 mit einem Ulbrichtkugel-Aufbau .

Der emittierte Photonenfluss ergibt sich aus dem leeren und spektral korrigierten Emissionsspektrum der Probe (Ix(λem)), integriert über das Emissionsband. Der absorbierte Photonenfluss wird aus der Differenz zwischen dem durchgelassenen Anregungslicht, das mit dem Rohling (Ib(λex)) und der Probe (Ix(λex)) erhalten wird, innerhalb des Wellenlängenbereichs der Anregungsbandbreite Δλ berechnet.

Reflexions- und Transmissionsmessungen wurden mit demselben Ulbrichtkugel-Aufbau wie die Quantenausbeutemessungen durchgeführt. Die Probe wurde in zylindrische kleinvolumige Quarzzellen mit einer Dicke von 1 mm gefüllt. Für jedes aufgezeichnete Messsignal eines Standards (Index std) oder einer Probe (Index S) oder einer leeren Kugel (Index empty) wurde eine Referenzmessung durchgeführt, um Änderungen des Vergrößerungsfaktors M(λ) zu berücksichtigen. Zur Berechnung des Reflexions- und Transmissionsgrads wurden die von mir ermittelten spektral aufgelösten Signale der Ulbrichtkugel in den Spektralbereich des Anregungslichts \(E = \int\limits_{{\lambda_{ex} - \Delta \lambda }}^ integriert {{\lambda_{ex} + \Updelta \lambda }} {I(\lambda_{{{\text{ex}}}} )} d\lambda_{{{\text{ex}}}}\). Die spektral aufgelöste Detektion hat den Vorteil, dass auch stark fluoreszierende Proben untersucht werden können. Ulbrichtkugeln, die nur mit Photomultiplier-Röhren oder Photodioden ausgestattet sind, können nicht zwischen Anregungs-/Einfallslicht und der rotverschobenen Lumineszenz unterscheiden und sind daher nicht für Reflexion und Transmission von Leuchtstoffen geeignet.

Für Messungen von Rd wurde die Probe mit speziellen Probenhaltern auf der Rückseite der Ulbrichtkugel (R-Port Abb. 2b)) montiert. Rd wurde dann in Bezug auf NIST-zertifizierte Standards für diffuse Reflexion berechnet gemäß:

RStd(λ) entspricht dem zertifizierten Rd-Wert des Reflexionsstandards, Ee(λ) und ERef(λ) stehen für das Detektorsignal bei direkter bzw. indirekter Probenbeleuchtung. ED zeigt eine Dunkelmessung an, um einen Signalversatz zu entfernen. Die Indizes S und Std stehen für Messungen der Probe bzw. des an der Reflexionsöffnung angebrachten Standards. In die Messungen wurde die erste Reflexion der Glasoberfläche der Probe (RFresnel) einbezogen.

Für jede Transmissionsmessung wurde die Probe an der Eintrittsöffnung der Ulbrichtkugel montiert. Die durchgelassene Strahlung (Ttotal) kann in zwei Teile unterteilt werden, die direkt oder kollimiert (Tc) und die diffus (Td) durchgelassene Strahlung:

Kollimiert durchgelassene Photonen passieren die Probe ohne Wechselwirkung und haben daher die gleiche Ausbreitungsrichtung wie die einfallenden Photonen, während diffus durchgelassene Photonen mindestens einmal gestreut werden. Die Gesamtdurchlässigkeit wurde mit der in Abb. 2c) gezeigten Ulbrichtkugel-Konfiguration gemessen und mit Gl. berechnet. (8). Mit der gleichen Konfiguration, aber einem offenen Port auf der Rückseite der Ulbrichtkugel (R-Port), kann der diffuse Transmissionsgrad bestimmt werden, siehe Abb. 2d) und Gl. (8).

Im Prinzip kann Tc aus dem gesamten und diffus durchgelassenen Photonenfluss berechnet werden (Gl. 7). Der offene R-Anschluss für Messungen von Rd führt jedoch zu Verlusten diffus gestreuter Photonen, was zu einer falschen Berechnung von Tc führt. Diese Fehler korrelieren mit der Größe des R-Anschlusses und dem Durchmesser der Ulbrichtkugel. Daher wurde zur Messung von Tc ein Fallendetektor verwendet. Unser Fallendetektor besteht aus drei Silizium-Fotodioden, die in einer 60°-Geometrie angeordnet sind, um das einfallende Licht einzufangen. Dieser Fallendetektor mit einer Apertur von 0,5 mm wurde in einem Abstand von 1,5 m hinter der Probe positioniert, um den Raumwinkel für gestreute und emittierte Photonen zu verringern, die zu Tc-Messungen beitragen. Aus den Signalen des Fallendetektors ITrap wurde dann Tc berechnet:

In stark streuenden Medien kann die Ausbreitung von Licht durch die Strahlungstransporttheorie beschrieben werden:

Die Lichtverteilung innerhalb einer Probe wird durch L(r,s) definiert, was für die vektorisierte Strahlungsdichte am Punkt r in der Ausbreitungsrichtung s steht (dargestellt im SI in Abb. S2). Um das Lesen zu erleichtern, verzichten wir hier auf Vektornotationen. L(r,s) hängt von der Anzahl der absorbierenden und streuenden Partikel in der Probe ab, beschrieben durch µa und µs, die Absorptions- und Streukoeffizienten. p(s, \(\tilde{s}\) λ) ist die Phasenfunktion für Streuprozesse und \(d\Omega\) ist der Raumwinkel. S(r,s) ist ein Quellterm für die isotrop emittierte Fluoreszenz in der Probe am Punkt r und hängt von der Dichte der angeregten Fluorophore und L(r,s) an der Fluorophorposition ab. Die Ausbreitung des Lichts ist im SI in Abb. S2 dargestellt. Mit der Kenntnis der drei Parameter Tt, Tc (oder Td) und Rd kann die Strahlungstransporttheorie mit Ansätzen wie der Kubelka-Munk-Theorie, Monte-Carlo-Methoden und der Methode der inversen addierenden Verdoppelung (iAD) zur Berechnung gelöst werden probenspezifische Parameter µa, µs und g52,53,54,55,56. g ist der mittlere Kosinus der Streuphasenfunktion, der aus der Mie-Theorie berechnet werden kann. Typischerweise wird die Phasenfunktion auf ein vereinfachtes Modell wie die Henyey-Greenstein-Phasenfunktion (HG) oder die Gegenbauer-Kernel-Phasenfunktion57,58 reduziert. Um die Strahlungstransporttheorie zu lösen und die wellenlängenabhängigen Parameter µa(λ), µs(λ) und g(λ) zu bestimmen, verwendeten wir die frei zugängliche iAD-Methode von Prahl et al.52. Hier ist bereits die HG-Phasenfunktion implementiert, die am besten zur Streuphasenfunktion von Polystyrolpartikeln passt. Für lumineszierende Proben muss der Quellterm S(r,s), der von σa(λex) und Φpl des Luminophors abhängt, eliminiert werden. Außerdem muss die Erstreflexion der einfallenden Strahlung berücksichtigt werden.

Mit unserem Ansatz erfassen wir die spektral aufgelösten durchgelassenen und reflektierten Photonenflüsse (siehe Abschnitt „Reflexions- und Transmissionsmessungen“). Daher könnten wir emittierte Photonen vom einfallenden/durchgelassenen Licht trennen und die ungestörte Reflexion und Transmission berechnen. Dies ermöglicht die Lösung von Gl. (9) ohne Berücksichtigung des Quellterms für die Fluoreszenz (S(r,s)).

Die aus Reflexions- und Transmissionsmessungen ermittelten Streu- und Absorptionskoeffizienten sowie die Lösung der Strahlungstransporttheorie sind effektive Probenparameter und geben keinen direkten Aufschluss über die Eigenschaften einzelner Partikel. Wenn die Anzahl der Teilchen pro Volumeneinheit (Np) bekannt ist, können die Absorptions- und Streuquerschnitte (\({\upsigma }_{\mathrm{a},\mathrm{s}}(\uplambda ))\) direkt berechnet werden berechnet aus dem über die iAD-Methode berechneten Absorptionskoeffizienten \({\mu }_{a}(\lambda )\).

Bei polydispersen Proben ist dieser Querschnitt der Durchschnitt über die Größenverteilung. Wenn außerdem der Partikelradius rp bekannt ist, können die Streu- und Absorptionseffizienzen (Qa,s \((\lambda )\)) bestimmt werden. Qa,s \((\lambda )\) ist in Gl. definiert. (12) als Verhältnis des entsprechenden Querschnitts zum physikalischen Querschnitt eines Teilchens.

Die Bestimmung von Np kann ziemlich anspruchsvoll sein. Mit der Kenntnis des rp und seiner Verteilung kann eine definierte Probenmenge getrocknet und aus der resultierenden Masse und Dichte des Partikelmaterials die Anzahl der Partikel berechnet werden. Für diese Methode ist eine ausreichend große Probenmenge erforderlich. Leider lassen sich die getrockneten Partikel oft nicht leicht redispergieren. Auch ein Durchflusszytometer oder eine kalibrierte Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) können zur Bestimmung der Partikelkonzentration verwendet werden, allerdings müssen die Proben bei diesen Ansätzen oft stark verdünnt werden. rp kann beispielsweise auch durch Streumethoden wie dynamische oder statische Lichtstreuung (DLS, SLS) bestimmt werden, die die Streulichtintensitätsschwankung oder räumliche Intensitätsverteilung analysieren. Auch Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) oder NTA59,60 oder bildbasierte Techniken wie Transmissions- und Rasterelektronenmikroskopie (TEM, SEM) können eingesetzt werden. Die letztgenannten bildbasierten Methoden, die einzelne Partikel messen, können zeitaufwändig sein, da eine statistisch relevante Anzahl von Partikeln gemessen werden muss, um die Größenverteilung genau zu bestimmen.

Ein einfacher Ansatz, der keiner weiteren Instrumentierung bedarf, ist die theoretische Beschreibung optischer Teilcheneigenschaften mittels der rigorosen Streutheorie (Mie-Theorie), also der Lösung der Wellengleichung für sphärische Randbedingungen. σs(λ), σa(λ), p(λ) und g(λ) können theoretisch vorhergesagt und an die Lösung der Strahlungstransporttheorie angepasst werden.

Die Wirkungsquerschnitte (σa,s) werden aus den Grundparametern an und bn berechnet:

mit y = πmd/λmed und x = πd/λmed und den Ricatti-Bessel-Funktionen ψn und ζn. Diese Grundparameter hängen vom komplexen relativen Brechungsindex m zwischen Teilchen (np) und Medium (nmed), dem Teilchenradius (rP) ab ) und die Wellenlänge im äußeren Medium λmed = λ/nmed. Wir haben die Codes von Mätzler61 verwendet und diese modifiziert, um die wellenlängenabhängigen Streu- und Absorptionskoeffizienten zu berechnen. Schließlich haben wir einen Anpassungsalgorithmus der kleinsten Quadrate erstellt, der auf der Mie- und Strahlungstransporttheorie basiert. Eingabeparameter für diese Routine sind \({\mu }_{a}(\lambda )\), \({\mu }_{s}(\lambda )\), \({g}_{s}\ left(\lambda \right),\) und die Materialeigenschaften, z. B. die Brechungsindizes des Lösungsmittels und des Partikels62. Als freie Parameter für das Anpassungsverfahren wurden neben Np und rp auch die Breite der Größenverteilungsfunktion verwendet, um die Polydispersität der Perlendispersion zu berücksichtigen. Das Anpassungsverfahren liefert schließlich rp, Np und den Imaginärteil des Brechungsindex (n2) der Partikel. Alternativ kann der Realteil des Brechungsindex bestimmt werden, wenn die Partikelgröße bekannt ist63.

Zur genauen Bestimmung von rp mittels Anpassung ist eine charakteristische Wellenlängenabhängigkeit von \({\mu }_{s}(\lambda )\) erforderlich, die oszillierendes Verhalten (Mie-Resonanzen) zeigt. Dies hängt vom Lösungsmittel, Partikelmaterial und -größe sowie dem untersuchten Wellenlängenbereich ab. Beispielsweise können für in Wasser dispergierte Polystyrolpartikel mit einem Durchmesser in der Größenordnung von 1 µm und größer rp und Np bestimmt werden. Für Partikel, die keine charakteristische Wellenlängenabhängigkeit von µs(λ) aufweisen, ist die Kenntnis der Partikelgröße erforderlich, um die Anzahl der Partikel pro Volumeneinheit zu bestimmen. Dies ähnelt den zuvor vorgestellten Methoden, die auf Tc.64 basieren

Der Real- und Imaginärteil des komplexen Brechungsindex \({n\left(\lambda \right)={n}_{1}\left(\lambda \right)+{\text{i}}\hspace{0,17 em}{n}_{2}\left(\lambda \right)}\) eines Materials sind durch sogenannte Kramers-Kronig-Beziehungen (KK) verknüpft. Zum Beispiel ist \({n}_{1}\left(\lambda \right)\) mit \({n}_{2}\left(\lambda \right)\) verknüpft durch

Hierbei bezeichnet \(P\int\) den Cauchy-Hauptwert Integra und \(\lambda\) die Wellenlänge im Vakuum. Beachten Sie, dass das Integral über alle Wellenlängen (oder Frequenzen) von Null bis Unendlich gebildet wird. Der Realteil des Brechungsindex wird durch das Absorptionsspektrum bei allen anderen Wellenlängen beeinflusst.

Der komplexe Brechungsindex eines PSP, das einen Farbstoff in einer molaren intrapartikulären Konzentration \({c}^{\text{Farbstoff}}\) enthält, ist gegeben durch

Die Zunahme des Imaginärteils hängt mit dem molaren Extinktionskoeffizienten der Farbstoffe Nilrot und Itrybe zusammen

Die Einheit für die Brechungsindexinkremente \(\widetilde{\alpha }\left(\lambda \right), \widetilde{\gamma }\left(\lambda \right)\) ist die einer inversen molaren Konzentration – L/ Mol. Unter der Annahme, dass die Matrix (also Polystyrol) im hier betrachteten Wellenlängenbereich quasi nicht absorbiert, setzen wir \({n}_{2}^{\text{Matrix}}\left(\lambda \right) =0\). Unter der Annahme, dass außerhalb eines Wellenlängenbereichs \(\left[{\lambda }_{a},{\lambda }_{b}\right]\) (z. B. dem sichtbaren Bereich) die Absorption des Matrixmaterials Polystyrol erfolgt und der Farbstoff ähnlich ist, kann der Realteil des Brechungsindexinkrements entsprechend berechnet werden

Wenn die Spektren außerhalb des Bereichs \(\left[{\lambda }_{a},{\lambda }_{b}\right]\) nicht übereinstimmen, können zusätzliche konstante oder normaldisperse Terme mit positiven oder negativen Vorzeichen hinzukommen auftreten in \(\widetilde{\alpha }\left(\lambda \right)\).

Zur numerischen Auswertung haben wir gemessene Spektren des molaren Extinktionskoeffizienten \(\varepsilon \left(\lambda \right)\) verwendet, um \(\widetilde{\gamma }\left(\lambda \right)\) zu erhalten. Das Integral in Gl. (18) wurde dann in einem Bereich \(\left[{\lambda }_{a},{\lambda }_{b}\right]\) ausgewertet, der den Hauptpeak des Spektrums abdeckt. Für NR waren es 300–700 nm. Die Spektren wurden auf eine Schrittweite von 0,5 nm interpoliert und das (KK)-Integral numerisch ausgewertet65. Der Wellenlängengitterabstand der resultierenden \(\widetilde{\alpha }\left(\lambda \right)\)-Daten wurde für Mie-Streuungsberechnungen und den Vergleich mit gemessenen Spektren auf den gewünschten Wert (z. B. 5 nm) erhöht (Downsampling). .

Um den komplexen Brechungsindex für Mie-Berechnungen zu erhalten, haben wir die durchschnittliche Farbstoffbeladungskonzentration pro Partikel durch photometrische Messungen der Absorptionsspektren der Farbstoffmoleküle bestimmt, die bei der Partikelauflösung in THF freigesetzt wurden (siehe Abschnitt „Bestimmung der Partikeleigenschaften“) und Gl. (18).

Zur Beurteilung unserer Messverfahren und Algorithmen wurden verschiedene wässrige Dispersionen monodisperser, quasi nicht absorbierender Polystyrol-Mikrokugeln mit unterschiedlichen Partikeldurchmessern und definierten Konzentrationen verwendet. Beispiele sind in Abb. 3 und im SI in Abb. dargestellt. S3 (d ≈ 1 µm) und S4 (d ≈ 2,5 µm). Hier haben wir Tt, Tc und Rd einer PSP-Dispersion mit einem Durchmesser von ca. 1250 nm. Die Summe von Tt und Rd beträgt 0,95 aufgrund kleiner Streuverluste, die von der Probe und der Ulbrichtkugel-Geometrie abhängen (siehe Abb. 3a)). Diese Verluste können für Proben mit unterschiedlichen Streueigenschaften und Probendicken unterschiedlich sein, werden jedoch von Prahl et al.52 in der iAD-Routine berücksichtigt. Werden diese Verluste nicht vollständig kompensiert, kommt es zu einem Offset im Absorptionskoeffizienten. Folglich wurde die Strahlungstransporttheorie mit Tt, Tc und Rd als Eingabeparameter für alle Proben gelöst, um den wellenlängenabhängigen Streukoeffizienten (µs(λ), Abb. 3b)) und den wellenlängenabhängigen Anisotropiefaktor (g( λ), Abb. 3c)). Diese Ergebnisse wurden dann mit der Mie-Theorie angepasst, um Np und rp zu bestimmen, letzteres wurde zusätzlich mit DLS-Messungen validiert (Abb. 3d, was rp,DLS = 1291 nm ergibt). Das Anpassungsverfahren ergibt eine gute Übereinstimmung zwischen der Lösung des Strahlungstransports und der Mie-Theorie und die daraus resultierenden Partikelradien und Partikelkonzentrationen bestätigen die Eignung unseres Ansatzes.

Dispersion ungefärbter Polystyrolpartikel mit ca. 1,25 µm Durchmesser. (a) Diffuse Reflexion (Rd, Dreiecke), Gesamt- (Tt, Dreiecke) und kollimierte Transmission (Tc, ausgefüllte Kreise) und Summe von Rd und Tt (ausgefüllte Quadrate). (b) Streukoeffizient (µs), berechnet aus der Strahlungstransporttheorie (ausgefüllte Quadrate) und der Mie-Theorie (rote Linie). (c) Anisotropiefaktor g, berechnet aus der Strahlungstransporttheorie (ausgefüllte Quadrate) und der Mie-Theorie (rote Linie). (d) Größenverteilungsfunktion bestimmt mit DLS (durchgezogene Kreise, schwarze Linie) und Mie-Theorie (rote Linie).

Um unsere Methode mit absorbierenden und lumineszierenden Partikeln zu bewerten, wurden quasi-monodisperse Modellsysteme hergestellt und wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben charakterisiert. Wir haben uns auf Partikel mit Größen von 25 nm, 100 nm und 1 µm konzentriert, wobei letztere ein starkes anisotropes Streuverhalten (g > 0) zeigten. Die normalisierten Absorptions- und Emissionsspektren wässriger Dispersionen dieser mit Nilrot und Itrybe beladenen PSP unterschiedlicher Größe sind im SI in Abb. S5 dargestellt. Aufgrund der Farbstoffanfärbung der Partikel über ein zuvor optimiertes Quellverfahren, das z. B. durch Mikroskopie beurteilt wird, kann davon ausgegangen werden, dass die Farbstoffmoleküle homogen innerhalb der Partikel verteilt sind und die Kugelform der Partikel dabei erhalten bleibt.12,41 ,42,44 Dies ermöglicht eine Datenanalyse basierend auf der Mie-Theorie, wie bei den oben diskutierten ungefärbten Partikeln. Die Absorptions- und Emissionsspektren von Itrybe-beladenem PSP sind im Vergleich zum Ausgangsmolekül in Ethanol verbreitert, die jeweiligen Absorptions- und Emissionsmaxima stimmen jedoch überein. Im Fall von solvatochromem Nilrot sind die Absorptions- und Emissionsbanden von mit Nilrot gefärbtem PSP mit abnehmender PSP-Größe rotverschoben, was auf eine zunehmend polare Mikroumgebung hindeutet, in der sich die Farbstoffmoleküle mit verringerter PSP-Größe und damit erhöhtem Oberfläche-zu-Volumen befinden Verhältnis. Die entsprechenden \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) wässriger Dispersionen von mit Nilrot und Itrybe beladenen PSPs in Abhängigkeit von der PSP-Größe und Beladungskonzentration, d. h. dem durchschnittlichen Farbstoff-Farbstoff-Abstand, sind in dargestellt Abb. 4. Diese Abbildung zeigt gegensätzliche Trends für die von der Partikelgröße und der Farbstoffbeladung abhängigen \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) beider Farbstoffe. Wie im linken Feld von Abb. 4 gezeigt, nahmen die \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\)-Werte von mit Nilrot gefärbtem PSP mit abnehmender PSP-Größe und zunehmendem Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis ab. Im Gegensatz dazu nahm bei PSP, das Itrybe-Moleküle enthielt, \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) mit zunehmender Partikelgröße ab (rechtes Feld von Abb. 4). Bei beiden Farbstoffen führte dies zu einem Anstieg der Farbstoffbeladungskonzentration eine Verringerung von \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) (siehe auch SI, Abb. S7). Wir führen diese Trends auf (1) den Einfluss der Polarteilchenumgebung zurück, insbesondere im Fall der Ladungstransferfarbstoff Nilrot, dessen Fluoreszenz bekanntermaßen durch Wasserstoffbrückenbindungen und Polarität gelöscht wird, wie sich auch aus dem solvatochromen Emissionsverhalten von Nilrot ergibt (siehe SI, Abb. S5), (2) Farbstoff-Farbstoff-Wechselwirkungen und (3) Energieübertragungsprozesse zwischen Farbstoffmolekülen im PSP. Die beiden letztgenannten Faktoren werden durch die Abhängigkeit von \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) von der Farbstoffbeladungskonzentration gestützt (siehe Abb. 4 und SI). , Abb. S7)66,67,68,69,70. µa(λ) und µs(λ) der dispergierten 1 µm und 100 nm großen, mit Farbstoff beladenen PSPs, bestimmt durch Strahlungstransport und Mie-Theorie, sind in Abb. 5 dargestellt. Für Bei den 25 nm großen Partikeln waren die Streubeiträge zu klein, um zur Quantifizierung verwendet zu werden, und stellen die physikalische Größengrenze für unsere Studie und Methodenentwicklung dar. Für die Anpassung von µa(λ) und µs(λ) haben wir den Beitrag der Farbstoffmoleküle zur dielektrischen Funktion der Partikelmatrix durch Erhöhung des Imaginärteils des Brechungsindex berücksichtigt. In einem ersten Schritt wurde n2 als freie Variable verwendet und angenommen, dass die Partikelmatrix homogen mit Farbstoffmolekülen beladen ist. Die resultierenden σa(λ)-Werte sind in Abb. 6 dargestellt. Die resultierenden Np- und rp-Werte wurden auch für die Bestimmung von σa(λ) aus µa(λ) verwendet, das anhand der Strahlungstransporttheorie berechnet wurde. Für die hier verwendeten Partikelgrößen und Farbstoffkonzentrationen stimmen die direkte Bestimmung von σa(λ) aus Mie-Berechnungen und Berechnungen unter Verwendung der Strahlungstransporttheorie gut überein, wie in Abb. 5 dargestellt.

Photolumineszenz-Quantenausbeuten von 1 µm (Kreise), 100 nm (Quadrate) und 25 nm (Dreiecke) PSP beladen mit Nile Red41 (links) und Itrybe (rechts) in Abhängigkeit vom mittleren Abstand zwischen den Farbstoffmolekülen. Die Linien sind lediglich eine Orientierungshilfe für das Auge. Die gestrichelten Linien geben die max. \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) in Lösung der freien Farbstoffe, d. h. Itrybe gelöst in Ethanol und Nilrot in BOB.

Beispiel berechneter Streukoeffizienten (µs, oben, offene Kreise) und Absorptionskoeffizienten (µa, unten, gefüllte Kreise) aus Reflexions- und Transmissionsmessungen von mit Nilrot beladenem 1 µm (links) und 100 nm (rechts) PSP. Anpassungen der Mie-Theorie werden durch rote Linien angezeigt.

Links: Absorptionsquerschnitte von 100 nm (oben) und 1 µm (unten) PSP, beladen mit Nilrot (Kreise) und Itrybe (Quadrate) in Abhängigkeit von der eingebauten Anzahl an Farbstoffmolekülen pro Partikel. Rechts: Absorptionseffizienz (Qabs) des farbstoffbeladenen PSP in Abhängigkeit vom Imaginärteil für den Brechungsindex n2 für 1 µm PSP (durchgezogene Symbole) und 100 nm PSP (offene Symbole), beladen mit Nilrot (Kreise) und Itrybe ( Quadrate).

Bisher haben wir den Realteil des Brechungsindex und den Imaginärteil als unabhängige Größen behandelt. Bei den Mie-Streuungsberechnungen haben wir den Imaginärteil des farbstoffgefärbten PSP entsprechend einer Absorptionslinie des Farbstoffs Nilrot oder Itrybe festgelegt, aber angenommen, dass der Realteil dem des ungefärbten PSP entspricht. Wenn Gl. (16)–(18) werden auf die gefärbten Partikel angewendet, ein von der Farbstoffkonzentration abhängiger Beitrag zu \({n}_{1}\left(\uplambda \right)\), der eine anomale Dispersion (d. h. lokal) aufweist , wobei der Brechungsindex mit der Wellenlänge abnimmt), was bisher vernachlässigt wurde, und im Abschnitt „Materialien und Methoden“ für weitere Einzelheiten. Wir haben die Mie-Streuungsberechnungen wiederholt und dabei auch den Term aufgrund der KK-Beziehungen für den komplexen Brechungsindex der Partikel berücksichtigt. Die Ergebnisse dieses physikalisch vollständigeren Modells sind im SI in Abb. S6 für mit Nilrot gefärbtes 1 µm großes PSP dargestellt. Im Allgemeinen bleibt \({\mu }_{a}\left(\uplambda \right)\) praktisch unbeeinflusst vom KK-Beitrag zu \({n}_{1}\left(\uplambda \right)\), wohingegen sich einige spektrale Merkmale von \({\mu }_{s}\left(\uplambda \right)\) merklich veränderten. Da \({\mu }_{s}\left(\uplambda \right)\) zur Bestimmung der Partikelgröße und Partikelanzahlkonzentration verwendet wird, führt das Weglassen des KK-Terms zu einem Fehler in diesem Ansatz. Für die 1-µm-Partikel haben wir die entsprechende Unsicherheit auf etwa 5 % für den mittleren Partikeldurchmesser geschätzt, der entsprechend unterschätzt wird, und auf etwa 10 % für die Partikelkonzentration, die daher überschätzt wird, abhängig vom genauen Datenablauf Analyse. Für kleinere Partikel nimmt der Einfluss der KK-Beziehungen auf \({\mu }_{\mathrm{s}}\left(\uplambda \right)\) ab und kann für Durchmesser ≤ 100 nm vernachlässigt werden.

Wie im linken Feld von Abb. 6 gezeigt, stieg σa(λ) linear auf 7 × 104 und 1,8 × 107 eingebaute Nilrot- oder Itrybe-Moleküle für 100 nm und 1 µm PSP. Der Einfluss der Farbstoffbeladung auf die effektiven Partikeleigenschaften, d. h. Qabs und n2, ist im rechten Feld von Abb. 6 dargestellt. Für PSP mit einer Größe von 100 nm ist Qabs im Vergleich zu PSP mit einer Größe von 1 µm erheblich kleiner. Eine Extrapolation zeigt, dass auch für höhere Farbstoffbeladungskonzentrationen, also n2, die Effizienz linear ansteigt. Bei 1-µm-Partikeln ist die Beziehung zwischen Qabs und n2 nicht mehr linear, wenn die Farbstoffkonzentrationen über den in dieser Studie verwendeten Konzentrationen liegen.

Das Produkt aus \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) und σa(λ) kann verwendet werden, um die Helligkeit (B) eines Partikels zu berechnen, wie zuvor für den B-Wert eines Farbstoffmoleküls, wie gezeigt in Abb. 7. Für molekulare Luminophore wie Farbstoffmoleküle wird B typischerweise als Produkt von \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) und dem molaren dekadischen Absorptionskoeffizienten (ε(λ)) angegeben hängt von der Oszillatorstärke des emittierenden Dipols ab. Im Gegensatz zu Farbstoffmolekülen skaliert σa(λ) von Partikeln mit rp, n2 und \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\). Letzteres hängt mit der Anzahl der in das Partikel eingebauten Farbstoffmoleküle (siehe Abb. 4 und 6), den Farbstoff-Farbstoff-Wechselwirkungen und farbstoffspezifischen Eigenschaften wie der Oszillatorstärke und \({\Phi }_{\mathrm{pl }}\) in der jeweiligen Umgebung. Zuvor haben wir die Partikelhelligkeit aus dem Produkt der Anzahl der Moleküle pro Partikel, dem entsprechenden ε des Farbstoffs, bestimmt in einem Modelllösungsmittel wie BOB, und dem gemessenen \({\Phi }_{\mathrm{pl}} berechnet. \) der Teilchendispersion (\({{N}_{\mathrm{Dye}}\cdot\upvarepsilon ({\lambda }_{ex})\cdot \Phi }_{\mathrm{pl}}\) )27,71, siehe Abb. 7 (linkes Feld). Diese Näherung, die für kleine Partikel und niedrige Farbstoffbeladungskonzentrationen gilt, hat mehrere Nachteile. Wie im SI in Abb. S5 gezeigt, kann (1) ε von der Farbstoffumgebung abhängen und nur in einem Lösungsmittel gemessen werden, das die Farbstoffumgebung im Inneren des Partikels nachahmt. Nachahmung impliziert hier idealerweise eine vergleichbare Polarität und einen vergleichbaren Brechungsindex. (2) Für die Bestimmung von NDye müssen die Partikel gelöst werden und (3) für hohe Farbstoffbeladungskonzentrationen muss σa(λ) nicht unbedingt linear mit der Menge der eingebauten Farbstoffmoleküle zusammenhängen. Ein Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die B-Werte von sehr kleinen Partikeln ähnlich sind. Es können 25 nm große Polymerkügelchen bestimmt werden (Abb. 7, linkes Feld).

Links: Helligkeit mit der Einheit L/(mol*cm), berechnet als Produkt aus der Anzahl der Farbstoffmoleküle innerhalb eines Partikels (NDye), der Quantenausbeute und dem molaren dekadischen Absorptionskoeffizienten des jeweiligen Farbstoffs. Rechts: Ermittelte Helligkeitswerte mit der Einheit (1/cm2) in Abhängigkeit von der Farbstoffmenge pro nm3. 1 µm (vollständige Symbole) und 100 nm (offene Symbole) und 25 nm (offene Symbole mit zentriertem Punkt) PSP, beladen mit Nilrot (Kreise) und Itrybe (Quadrate). Beide Diagramme decken 7 Größenordnungen ab.

Die Definition der Teilchenhelligkeit nach Gl. (19) stellt eindeutig einen allgemeineren Ansatz dar, da alle Parameter experimentell mit der Ulbrichtkugel-Spektroskopie zugänglich sind (siehe Abb. 7, rechtes Feld). Ein direkter Vergleich der beiden Ansätze zur Bestimmung der B-Werte lumineszierender Partikel in den Einheiten (L/(mol*cm) und (1/cm2) ist in Abb. 7 (und SI, Abb. S8, zum einen) dargestellt Quellansatz).

Wie in den Abb. zu sehen ist. 4, 6 und 7 und in der ergänzenden Abbildung S8 ist \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) offenbar nicht die Größe, deren Wert die gemessene Signalamplitude dominiert, die für ein lumineszierendes Teilchen aufgezeichnet wurde. aber das σa(λ). Beispielsweise ist die letztgenannte Größe für 1-µm-PSP um den Faktor 100 bis 1000 größer als für 100-nm-PSP. Mit Itrybe beladene 1 µm große Partikel haben einen \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) von weniger als 1 %, zeigen aber einen B-Wert, der höher ist als der von 100 nm großen, mit Nilrot beladenen PSP, die a aufweisen \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) von 76 %. Abbildung 7 zeigt optimale Farbstoffbeladungskonzentrationen für hohe B-Werte. Offensichtlich wurden für beide Farbstoffe die höchsten B-Werte für einen Farbstoffbeladungskonzentrationsbereich von 0,83 × 10–8 bis 2,1 × 10–8 Mol pro mg PSP erhalten.

Um schließlich den Einfluss der physikalischen Größe der lumineszierenden Partikel aufzuheben und eine größenunabhängige Lumineszenzeffizienz (LE) für lumineszierende Partikel einzuführen, haben wir die Lumineszenzeffizienz (LE) von Dispersionen lumineszierender Partikel als Produkt der Photolumineszenz berechnet Quantenausbeute \({\Phi }_{\mathrm{pl}}\) und die Absorptionseffizienz (Qabs) eines Teilchens:

LE-Werte, wie sie hier von uns definiert werden, sind eine einheitenlose Zahl zwischen 0 und 1 und stellen das Verhältnis der auf den Partikelquerschnitt einfallenden Photonen und der vom Partikel emittierten Photonen dar (siehe Abb. 8).

Lumineszenzeffizienz LE von 1 µm (vollständige Symbole) und 100 nm (offene Symbole) PSP beladen mit Nilrot (Kreise) und Itrybe (Quadrate).

In Bezug auf LE (Abb. 8) übertreffen 100 nm Nilrot-gefärbte PSP deutlich 1 µm Itrybe-beladene PSP. Darüber hinaus ist der Partikel-LE, skaliert über die eingebaute Farbstoffmenge pro 3 mg PSP, im SI in Abb. S9 dargestellt. Für Anwendungen, bei denen Partikelensembles und nicht einzelne Partikel verwendet werden, wie z. B. auf Analyten reagierende Nanosensoren, Trägerkügelchen für perlenbasierte Assays oder Licht- oder Energieumwandlungsschichten, kann der Partikel-LE, der die Photonenverschiebungseffizienz widerspiegelt, der wichtigere Parameter für die Charakterisierung sein von Leuchtpartikeln und der Vergleich ihrer Leistung.

Zusammenfassend haben wir eine Helligkeitsskala (B) für die Leistungsbewertung und den Vergleich lichtstreuender Dispersionen lumineszierender Partikel vorgestellt, die die signalrelevanten optischen Eigenschaften der Partikel in Form grundlegender spektroskopischer Größen ausdrückt. Diese Helligkeitsskala basiert auf Messungen des Absorptionsquerschnitts und der Photolumineszenz-Quantenausbeute (Φpl) mit einem einzigen Ulbrichtkugel-Aufbau, der speziell entwickelt wurde, um die absolute Bestimmung von Φpl ​​sowie Transmissions- und diffuse Reflexionsmessungen zu ermöglichen.

Dieses Konzept zur Klassifizierung der Partikel-B-Werte wurde beispielhaft für wässrige Dispersionen quasi-monodisperser kugelförmiger Polystyrolpartikel mit einer Größe von 25 nm, 100 nm und 1 µm gezeigt, die mit zwei Farbstoffen in unterschiedlichen Konzentrationen homogen kerngefärbt waren. Diese Fluorophore wurden ausgewählt, um sich in ihrem solvatochromen Verhalten und der spektralen Überlappung zwischen ihren Absorptions- und Emissionsbanden und damit in der Reabsorption zu unterscheiden. Anschließend wurden Φpl ​​dieser Materialien und die optischen Eigenschaften, also die Absorptions- und Streukoeffizienten µa und µs, aus Lösungen der Strahlungstransporttheorie basierend auf Reflexions- und Transmissionsmessungen der Partikeldispersionen mit unserem Ulbrichtkugel-Aufbau bestimmt. Dieses Verfahren wurde mit ungefärbten Materialien validiert. Für unsere Modellverbindungen haben wir außerdem σa(λ), n2 und Qabs(λ) in Abhängigkeit von der Anzahl der eingebauten Farbstoffmoleküle unter Berücksichtigung der Mie-Theorie berechnet. Schließlich haben wir eine einheitenlose Lumineszenzeffizienz (LE) als Produkt aus Absorptionseffizienz und Φpl definiert, die effektiv den Anteil der absorbierten und reemittierten Photonen eines Partikels darstellt, und diese Werte für farbstoffgefärbte Partikel ermittelt.

Insgesamt ermöglicht das beschriebene Verfahren die Bestimmung der Streu- und Absorptionseigenschaften lichtstreuender partikelhaltiger Medien, die Bestimmung von Anzahlkonzentrationen und Materialkonstanten sowie die Identifizierung der Partikel mit der besten Lumineszenzleistung für technische und biologische Anwendungen nur ein Ulbrichtkugel-Setup. Die untere Grenze der Partikelgröße liegt je nach Partikel- und Lösungsmittelbrechungsindex bei etwa 50 nm. Dieses Konzept, das auch mit einem Photometer, das mit einer Ulbrichtkugel ausgestattet ist, und einem eigenständigen Ulbrichtkugel-Aufbau zur absoluten Messung von Φpl-Werten verwirklicht werden kann, hat das Potenzial, relative Intensitätsvergleiche zu überwinden und kann eine allgemeinere Intensitätsskala für Photolumineszenz liefern lichtstreuende Partikel. In Zukunft werden wir die Implementierung der Kramers-Kronig-Beziehungen in den Mie-Anpassungsalgorithmus im Hinblick auf ein optimiertes Parametergewicht weiter untersuchen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen Zusatzinformationsdateien (SI)) enthalten oder auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Mosshammer, M., Brodersen, KE, Kuhl, M. & Koren, K. Nanopartikel- und mikropartikelbasierte Lumineszenzbildgebung chemischer Spezies und Temperatur in aquatischen Systemen: Eine Übersicht. Mikrochim. Acta 186, 2. https://doi.org/10.1007/s00604-018-3202-y (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Rodiger, S. et al. Nukleinsäurenachweis mithilfe von Mikrokügelchen: Eine Übersicht. Mikrochim. Acta 181, 1151–1168. https://doi.org/10.1007/s00604-014-1243-4 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Carrillo-Carrion, C., Escudero, A. & Parak, WJ Optische Erfassung durch Integration eines analytempfindlichen Fluorophors in Partikel. Trac-Trends Anal. Chem. 84, 84–96. https://doi.org/10.1016/j.trac.2016.05.001 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Clark, HA, Kopelman, R., Tjalkens, R. & Philbert, MA Optische Nanosensoren für die chemische Analyse in einzelnen lebenden Zellen. 2. Sensoren für pH-Wert und Kalzium und die intrazelluläre Anwendung von PEBBLE-Sensoren. Anal. Chem. 71, 4837–4843. https://doi.org/10.1021/ac990630n (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kromer, C. et al. Überwachung und Darstellung des pH-Werts in Biofilmen mithilfe eines fluoreszierenden Polymer-Nanosensors. Wissenschaft. Rep. 12, 1. https://doi.org/10.1038/s41598-022-13518-1 (2022).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Srivastava, P. et al. Mehrfarbige Polystyrol-Nanosensoren zur Überwachung saurer, neutraler und basischer pH-Werte sowie für Studien zur zellulären Aufnahme. Anal. Chem. 94, 9656–9664. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c00944 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shao, S. et al. Herstellung fluoreszenzkodierter Mikrokügelchen mit großen Kodierungskapazitäten und Anwendung der Suspension-Array-Technologie. Neue J. Chem. https://doi.org/10.1039/D2NJ00628F (2022).

Artikel Google Scholar

Zhang, J., Shikha, S., Mei, Q., Liu, J. & Zhang, Y. Fluoreszierende Mikrokügelchen für Point-of-Care-Tests: Eine Übersicht. Mikrochim. Acta 186, 361. https://doi.org/10.1007/s00604-019-3449-y (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Sowa, M. et al. Autoantikörpertests der nächsten Generation durch Kombination von Screening und Bestätigung – die CytoBeadA(R)-Technologie. Klin. Rev. Allergy Immunol. 53, 87–104. https://doi.org/10.1007/s12016-016-8574-3 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Perfetto, SP, Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P. & Roederer, M. Qualitätssicherung für polychromatische Durchflusszytometrie. Nat. Protokoll. 1, 1522–1530 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, LL & Gaigalas, AK Entwicklung von Kalibrierungsstandards für die mehrfarbige Durchflusszytometrie: Zuweisung einer Einheit für äquivalente Referenzfluorophore (ERF). J. Res. Nat. Inst. Stand. Technol. 116, 671–683. https://doi.org/10.6028/jres.116.012 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Hoffmann, K., Nirmalananthan-Budau, N. & Resch-Genger, U. Fluoreszenzkalibrierungsstandards aus in Polymerkügelchen eingekapselten Breitbandemittern für Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie. Anal. Bioanal. Chem. 412, 6499–6507. https://doi.org/10.1007/s00216-020-02664-y (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, Y. et al. Die Entwicklung von Quantenpunkt-Kalibrierungskügelchen und quantitativen Mehrfarben-Bioassays in der Durchflusszytometrie und Mikroskopie. Anal. Biochem. 364, 180–192. https://doi.org/10.1016/j.ab.2007.02.006 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Resch-Genger, U. et al. So verbessern Sie die Qualitätssicherung in der Fluorometrie: Fluoreszenzinhärente Fehlerquellen und geeignete Fluoreszenzstandards. J. Fluoresc. 15, 337–362 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Resch-Genger, U., Hoffmann, K. & Pfeifer, D. In Reviews in Fluoreszenz Vol. 4 Rezensionen in Fluoreszenz (Hrsg. Geddes, CD) Kap. 1, 1–32 (Springer Science Business Media, Inc., 2009).

Resch-Genger, U. & DeRose, PC Charakterisierung von Photolumineszenz-Messsystemen (IUPAC Technical Report). Reine Appl. Chem. 84, 1815–1835. https://doi.org/10.1351/PAC-REP-10-07-07 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Resch-Genger, U. & de-Rose, P. Fluoreszenzstandards: Klassifizierung, Terminologie und Empfehlungen zu ihrer Auswahl, Verwendung und Produktion (IUPAC Technical Report). Reine Appl. Chem. 82, 2315–2335 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Schwartz, A., Repollet, EF, Vogt, R. & Gratama, JW Standardisierung der Durchflusszytometrie: Erstellung eines standardisierten Fluoreszenzkalibrierungsdiagramms unter Verwendung passender Spektralkalibratoren. Zytometrie 26, 22–31. https://doi.org/10.1002/(sici)1097-0320(19960315)26:1%3c22::aid-cyto4%3e3.0.co;2-i (1996).

3.0.co;2-i" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28sici%291097-0320%2819960315%2926%3A1%3C22%3A%3Aaid-cyto4%3E3.0.co%3B2-i" aria-label="Article reference 18" data-doi="10.1002/(sici)1097-0320(19960315)26:13.0.co;2-i">Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schwartz, A. et al. Formalisierung der MESF-Einheit der Fluoreszenzintensität. Zytometrie Teil B – Klinische Zytometrie 57B, 1–6 (2004).

Artikel Google Scholar

Marti, GE et al. Fluoreszenzkalibrierung und quantitative Messung der Fluoreszenzintensität, anerkannte Richtlinie. IN NCCLS, I/LA24-A 24 (2004).

Wong, KL, Bunzli, JCG & Tanner, PA Quantenausbeute und Helligkeit. J. Luminesc. 224, 117256. https://doi.org/10.1016/j.jlumin.2020.117256 (2020).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Waxdal, MJ, Monical, MC & Palini, AG Laborübergreifende relative Fluoreszenzintensitätsmessungen mit FlowCal 575-Kalibrierungskügelchen: Eine Basisstudie. Cytometry 33, 213–218 (1998).

3.0.CO;2-X" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-0320%2819981001%2933%3A2%3C213%3A%3AAID-CYTO16%3E3.0.CO%3B2-X" aria-label="Article reference 22" data-doi="10.1002/(SICI)1097-0320(19981001)33:23.0.CO;2-X">Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lenkei, R. et al. Durchführung von Kalibrierungsstandards für die Antigenquantifizierung mittels Durchflusszytometrie. Zytometrie 33, 188–196. https://doi.org/10.1002/(sici)1097-0320(19981001)33:2%3c188::aid-cyto13%3e3.0.co;2-q (1998).

3.0.co;2-q" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28sici%291097-0320%2819981001%2933%3A2%3C188%3A%3Aaid-cyto13%3E3.0.co%3B2-q" aria-label="Article reference 23" data-doi="10.1002/(sici)1097-0320(19981001)33:23.0.co;2-q">Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, L. et al. Quantifizierung von Zellen mit spezifischen Phänotypen II: Bestimmung des CD4-Expressionsniveaus auf rekonstituierten lyophilisierten menschlichen PBMC, die mit Anti-CD4-FITC-Antikörper markiert sind. Zytometrie A 87A, 254–261. https://doi.org/10.1002/cyto.a.22634 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Saraiva, L. et al. Vergleich der volumetrischen und perlenbasierten Zählung von CD34-Zellen mittels Einzelplattform-Durchflusszytometrie. Zytometrie Teil B-Klin. Zytometrie 96, 508–513. https://doi.org/10.1002/cyto.b.21773 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hoffman, RA, Wang, LL, Bigos, M. & Nolan, JP NIST/ISAC-Standardisierungsstudie: Variabilität bei der Zuordnung von Intensitätswerten zu Fluoreszenzstandardkügelchen und bei der Kreuzkalibrierung von Standardkügelchen mit hartgefärbten Kügelchen. Zytometrie A 81A, 785–796. https://doi.org/10.1002/cyto.a.22086 (2012).

Artikel Google Scholar

Huber, A., Behnke, T., Würth, C., Jaeger, C. & Resch-Genger, U. Spektroskopische Charakterisierung von Cumarin-gefärbten Perlen: Quantifizierung der Anzahl von Fluorophoren pro Partikel mit Festkörper-19F-NMR und Messung absoluter Fluoreszenzquantenausbeuten. Anal. Chem. 84, 3654–3661. https://doi.org/10.1021/ac3000682 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lakowicz, JR Prinzipien der Fluoreszenzspektroskopie 3. Aufl. (Springer Science+Business Media LLC, 2006).

Buchen Sie Google Scholar

Williams, ND et al. DNA-Origami-basierte Fluoreszenzhelligkeitsstandards für eine bequeme und schnelle Proteinzählung in lebenden Zellen. Nano Lett. 20, 8890–8896. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c03925 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yuxi, T., Johannes, H., Michal, W., Dibakar, S. & Ivan, GS Quantitative Messung der Fluoreszenzhelligkeit einzelner Moleküle. Methoden Appl. Fluoresz. 2, 035003 (2014).

Artikel Google Scholar

Würth, C. & Resch-Genger, U. Bestimmung der Photolumineszenz-Quantenausbeute streuender Medien mit einer Ulbrichtkugel: Direkte und indirekte Beleuchtung. Appl. Spectrosc. 69, 749–759. https://doi.org/10.1366/14-07679 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Valenta, J. Bestimmung der absoluten Quantenausbeuten lumineszierender Nanomaterialien über einen breiten Spektralbereich: Von der Ulbrichtkugel-Theorie zur richtigen Methodik. Nanowissenschaften. Methoden 3, 11–27. https://doi.org/10.1080/21642311.2014.884288 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Kobayashi, A., Suzuki, K., Yoshihara, T. & Tobita, S. Absolute Messungen der Photolumineszenz-Quantenausbeuten von 1-Halogonaphthalinen in einer starren 77K-Lösung unter Verwendung eines Ulbrichtkugel-Instruments. Chem. Lette. 39, 282–283. https://doi.org/10.1246/cl.2010.282 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Hasebe, N. et al. Absolute Phosphoreszenzquantenausbeuten von Singulett-molekularem Sauerstoff in Lösung, bestimmt mit einem Ulbrichtkugel-Instrument. Anal. Chem. 87, 2360–2366. https://doi.org/10.1021/ac5042268 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Meijer, MS et al. Absolute Upconversion-Quantenausbeuten von blau emittierenden LiYF4: Yb3+, Tm3+ Upconverting-Nanopartikeln. Physik. Chem. Chem. Physik. 20, 22556–22562. https://doi.org/10.1039/c8cp03935f (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gaigalas, AK & Wang, LL Messung der Fluoreszenzquantenausbeute mit einem Spektrometer mit Ulbrichtkugel-Detektor. J. Res. Nat. Inst. Stand. Technol. 113, 17–28. https://doi.org/10.6028/jres.113.004 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Leyre, S. et al. Absolute Bestimmung der Photolumineszenz-Quanteneffizienz mithilfe eines Ulbrichtkugel-Aufbaus. Rev. Sci. Instrument. 85, 9. https://doi.org/10.1063/1.4903852 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Herz, E. et al. Relative Quantenausbeutemessungen von Cumarin, eingekapselt in Kern-Schale-Silica-Nanopartikeln. J. Fluoresc. 20, 67–72 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Martini, M. et al. So messen Sie Quantenausbeuten in Streumedien: Anwendung zur Quantenausbeutemessung von Fluoresceinmolekülen, die in Siliciumdioxidpartikeln unter 100 nm eingekapselt sind. J. Appl. Physik. 106, 094304. https://doi.org/10.1063/1.3248302 (2009).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Russin, TJ, Altinoglu, EI, Adair, JH & Eklund, PC Messung der fluoreszierenden Quanteneffizienz von Indocyaningrün, eingekapselt in Nanokompositpartikeln. J. Phys.-Condens. Materie 22, 9. https://doi.org/10.1088/0953-8984/22/33/334217 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Behnke, T. et al. Einkapselung hydrophober Farbstoffe in Mikro- und Nanopartikel aus Polystyrol durch Quellverfahren. J. Fluoresc. 21, 937–944. https://doi.org/10.1007/s10895-010-0632-2 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Behnke, T., Würth, C., Laux, E.-M., Hoffmann, K. & Resch-Genger, U. Einfache Strategien für helle Polymerpartikel durch einstufige Färbeverfahren. Farbstoffe Pigm. 94, 247–257 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Felbeck, T. et al. Nil-Rot-Nanoton-Hybride: Rot emittierende optische Sonden zur Verwendung in wässrigen Dispersionen. Langmuir 29, 11489–11497. https://doi.org/10.1021/la402165q (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Behnke, T. et al. Zielspezifische Nanopartikel mit einem breitbandig emittierenden NIR-Farbstoff zur empfindlichen Erkennung und Charakterisierung der Tumorentwicklung. Biomaterialien 34, 160–170. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2012.09.028 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Hoffmann, K., Behnke, T., Grabolle, M. & Resch-Genger, U. In Nanopartikeln eingekapselte sichtbare und NIR-emittierende Fluorophore mit unterschiedlichen Fluoreszenzzerfallskinetiken für lebenslanges Multiplexing. Anal. Bioanal. Chem. 406, 3315–3322. https://doi.org/10.1007/s00216-013-7597-3 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Würth, C., Pauli, J., Lochmann, C., Spieles, M. & Resch-Genger, U. Ulbrichtkugel-Aufbau zur rückführbaren Messung absoluter Photolumineszenz-Quantenausbeuten im nahen Infrarot. Anal. Chem. 84, 1345–1352. https://doi.org/10.1021/ac2021954 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hollandt, J. et al. Rückverfolgbarkeit in der Fluorometrie – Teil I: Physikalische Standards. J. Fluoresc. 15, 301–313 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Laux, E.-M., Behnke, T., Hoffmann, K. & Resch-Genger, U. Partikel brillant halten – einfache Methoden zur Bestimmung des Farbstoffgehalts von mit Fluorophoren beladenen Polymerpartikeln. Anal. Methoden 4, 1759–1768 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Goebel, DG Verallgemeinerte Ulbrichtsphärentheorie. Appl. Opt. 6, 125–128. https://doi.org/10.1364/ao.6.000125 (1967).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M. & Resch-Genger, U. Vergleich von Methoden und erreichbaren Unsicherheiten für die relative und absolute Messung von Photolumineszenz-Quantenausbeuten. Anal. Chem. 83, 3431–3439 (2011).

Artikel PubMed Google Scholar

Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M. & Resch-Genger, U. Relative und absolute Bestimmung der Fluoreszenzquantenausbeute transparenter Proben. Nat. Protokoll. 8, 1535–1550. https://doi.org/10.1038/nprot.2013.087 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Prahl, SA, Vangemert, MJC & Welch, AJ Bestimmung der optischen Eigenschaften trüber Medien mithilfe der Additionsverdopplungsmethode. Appl. Opt. 32, 559–568 (1993).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Jonsson, JC, Smith, GB & Niklasson, GA Experimentelle und Monte-Carlo-Analyse der isotropen multiplen Mie-Streuung. Opt. Komm. 240, 9–17. https://doi.org/10.1016/j.optcom.2004.06.017 (2004).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Palmer, GM & Ramanujam, N. Monte-Carlo-basiertes inverses Modell zur Berechnung der optischen Eigenschaften von Gewebe. Teil I: Theorie und Validierung synthetischer Phantome. Appl. Opt. 45, 1062–1071. https://doi.org/10.1364/AO.45.001062 (2006).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Galbán, J., Delgado-Camón, A., Sanz, V., Sanz-Vicente, I. & de Marcos, S. Ein theoretischer Ansatz für die Entwicklung fluoreszierender reagenzloser Biosensoren: Das optische Modell. Anal. Chim. Acta 615, 148–157. https://doi.org/10.1016/j.aca.2008.03.063 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Giraev, KM, Ashurbekov, NA & Kobzev, OV Optische Charakterisierung biologischer Gewebe: Bestimmung von Absorptions- und Streukoeffizienten. Technik. Physik. Lette. 29, 901–903. https://doi.org/10.1134/1.1631358 (2003).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Binzoni, T., Leung, TS, Gandjbakhche, AH, Ruefenacht, D. & Delpy, DT Die Verwendung der Henyey-Greenstein-Phasenfunktion in Monte-Carlo-Simulationen in der biomedizinischen Optik. Physik. Med. Biol. 51, N313–N322. https://doi.org/10.1088/0031-9155/51/17/n04 (2006).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Yaroslavsky, AN, Yaroslavsky, IV, Goldbach, T. & Schwarzmaier, HJ Einfluss der Streuphasenfunktionsnäherung auf die optischen Eigenschaften von Blut, bestimmt aus den Ulbrichtkugel-Messungen. J. Biomed. Opt. 4, 47–53. https://doi.org/10.1117/1.429920 (1999).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Filipe, V., Hawe, A. & Jiskoot, W. Kritische Bewertung der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) von NanoSight zur Messung von Nanopartikeln und Proteinaggregaten. Pharm. Res. 27, 796–810. https://doi.org/10.1007/s11095-010-0073-2 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shang, J. & Gao, XH Nanopartikelzählung: Auf dem Weg zur genauen Bestimmung der molaren Konzentration. Chem. Soc. Rev. 43, 7267–7278. https://doi.org/10.1039/c4cs00128a (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mätzler, C. Matlab-Funktionen für Mie-Streuung und -Absorption, Version 2. Institut für Angewandte Physik, Universität Bern. https://doi.org/10.7892/boris.146550 (2002).

Harvey, AH, Gallagher, JS & Sengers, J. Überarbeitete Formulierung für den Brechungsindex von Wasser und Dampf als Funktion von Wellenlänge, Temperatur und Dichte. J. Phys. Chem. Ref. Daten 27, 761–774 (1998).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Ma, XY et al. Bestimmung des komplexen Brechungsindex von Polystyrol-Mikrokugeln von 370 bis 1610 nm. Physik. Med. Biol. 48, 4165–4172. https://doi.org/10.1088/0031-9155/48/24/013 (2003).

Artikel PubMed Google Scholar

Gienger, J., Bar, M. & Neukammer, J. Extinktionsspektren von Suspensionen von Mikrokügelchen: Bestimmung des spektralen Brechungsindex und der Partikelgrößenverteilung mit Nanometergenauigkeit. Appl. Opt. 57, 344–355. https://doi.org/10.1364/ao.57.000344 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Gienger, J., Gross, H., Neukammer, J. & Bar, M. Bestimmung des Brechungsindex menschlicher Hämoglobinlösungen durch Kramers-Kronig-Beziehungen mit einem verbesserten Absorptionsmodell. Appl. Opt. 55, 8951–8961. https://doi.org/10.1364/ao.55.008951 (2016).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Rodriguez, HB & Roman, ES In Fluoreszenzmethoden und -anwendungen: Spektroskopie, Bildgebung und Sonden Vol. 1130 Annals of the New York Academy of Sciences (Hrsg. Wolfbeis, OS) 247–252 (2008).

Rodriguez, HB & Roman, ES Einfluss der Konzentration auf die Photophysik von Farbstoffen in lichtstreuenden Materialien. Photochem. Photobiol. 89, 1273–1282. https://doi.org/10.1111/php.12107 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rodriguez, HB, Iriel, A. & San-Roman, E. Energieübertragung zwischen Farbstoffen auf partikulären Feststoffen. Photochem. Photobiol. 82, 200–207 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rodriguez, HB & Roman, ES Energieübertragung von chemisch gebundenem Rhodamin 101 zu adsorbiertem Methylenblau auf mikrokristallinen Cellulosepartikeln. Photochem. Photobiol. 83, 547–555. https://doi.org/10.1562/2006-08-01-ra-993 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hennig, A., Hatami, S., Spieles, M. & Resch-Genger, U. Anregungsenergiemigration und Einfangen auf der Oberfläche fluoreszierender Poly(acrylsäure)-gepfropfter Polymerpartikel. Photochem. Photobiol. Wissenschaft. 12, 729–737. https://doi.org/10.1039/c2pp25364j (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhou, H. et al. Zellfreie Helligkeitsmessungen fluoreszenzmarkierter Antikörper. Wissenschaft. Rep. 7, 41819. https://doi.org/10.1038/srep41819 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Dieses Projekt (METVES II; Fördernummer 18HLT01) wurde aus dem von den teilnehmenden Staaten kofinanzierten EMPIR-Programm und aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union finanziert. Wir bedanken uns für Diskussionen der Projektergebnisse mit Dr. D. Geißler (BAM), Dr. E. van der Pol und Rienk Nieuwland (Universität Amsterdam, AMC) und Dr. Martine Kuiper (VSL). Darüber hinaus dankt UR der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG; Stipendium SIREN) für die Förderung.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Division Biophotonics, Bundesanstalt für Materialforschung und –prüfung (BAM), Richard-Willstaetter Str. 11, 12489, Berlin, Germany

Christian Würth, Thomas Behnke & Ute Resch-Genger

Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB), Abbestr. 2–12, 10587, Berlin, Germany

Jonas Gienger

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

TB bereitete die farbstoffgefärbten Partikel vor und charakterisierte sie analytisch. JG führte die Simulation und Datenanalyse mit der Mie-Theorie und den Kramers-Kronig-Beziehungen durch. CW entwarf den Ulbrichtkugel-Aufbau, baute ihn, führte die spektroskopischen Messungen und die verbleibende Datenanalyse durch. CW und UR leiteten die Diskussionen und verfassten das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und genehmigt.

Correspondence to Christian Würth or Ute Resch-Genger.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Würth, C., Behnke, T., Gienger, J. et al. Effizienzskala für die Streuung lumineszierender Partikel in Verbindung mit grundlegenden und messbaren spektroskopischen Eigenschaften. Sci Rep 13, 6254 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32933-6

Zitat herunterladen

Eingegangen: 25. Januar 2023

Angenommen: 04. April 2023

Veröffentlicht: 17. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32933-6

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.