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Jun 14, 2023

Funktionalisierte Graphenoxid-Nanoblätter mit Folsäure und Seidenfibroin als neuartiges Nanobiokomposit für biomedizinische Anwendungen

Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 6205 (2022) Diesen Artikel zitieren 3126 Zugriffe 10 Zitate 9 Details zu altmetrischen Metriken In diesem Artikel wird ein neuartiges Graphenoxid-Folsäure/Seidenfibroin beschrieben

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 6205 (2022) Diesen Artikel zitieren

3126 Zugriffe

10 Zitate

9 Altmetrisch

Details zu den Metriken

In dieser Arbeit wurde ein neuartiges Nanobiokomposit-Gerüst aus Graphenoxid-Folsäure/Seidenfibroin (GO-FA/SF) unter Verwendung erschwinglicher und ungiftiger Materialien entworfen und hergestellt. Das GO wurde mithilfe der Hummer-Methode synthetisiert, mit FA kovalent funktionalisiert und anschließend über den Gefriertrocknungsprozess problemlos mit extrahiertem SF konjugiert. Zur Charakterisierung des Gerüsts wurden mehrere Techniken eingesetzt: Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR), Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM), energiedispersive Röntgenstrahlung (EDX) und thermogravimetrische Analyse (TGA). Die Zelllebensfähigkeitsmethode, Hämolyse und Anti-Biofilm-Tests wurden durchgeführt, um die biologische Leistungsfähigkeit des Nanobiokomposits zu untersuchen. Die Prozentsätze der Zelllebensfähigkeit betrugen 96,67, 96,35 und 97,23 % für 24, 48 bzw. 72 Stunden, und die hämolytische Wirkung betrug weniger als 10 %. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass dieses Nanobiokomposit die Bildung von Pseudomonas aeruginosa-Biofilm verhindert und antibakteriell wirkt.

Graphen, eine zweidimensionale Schichtstruktur aus sechseckig angeordneten Kohlenstoffatomen mit großer Oberfläche, wurde in den letzten Jahrzehnten eingehend untersucht. Aufgrund seiner einzigartigen chemischen Eigenschaften hat es großes Interesse geweckt1,2,3,4,5. Graphen ist strukturell in der Lage, seine Kohlenstoffplattform zu modifizieren und zu funktionalisieren, um analoge Produkte zu ergeben, darunter Graphen-Nanoblätter, Graphenoxid (GO) und reduziertes Graphenoxid (rGO)6. Nach der Hummers-Methode reagiert Graphit mit starken Oxidationsmitteln wie Kaliumpermanganat und konzentrierter Schwefelsäure und erzeugt eine gelbe kolloidale Dispersion namens GO, sodass man sagen kann, dass GO das Oxidationsprodukt von Graphit ist7. Es besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der endgültigen Struktur und den chemischen Eigenschaften von Graphen sowie seiner Synthesemethode und dem Oxidationsgrad8,9. Es gibt Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen GO und Graphen. Beide haben Schichtstrukturen mit einem Wabengitter aus Kohlenstoffatomen, die über σ-Bindungen miteinander verbunden sind, wobei die π-Orbitale der Kohlenstoffatome ein delokalisiertes Elektronennetzwerk durch das Gitter bilden. Im Gegensatz zu Graphen ermöglicht das Vorhandensein sauerstoffhaltiger funktioneller Gruppen an der Oberfläche von GO wie Epoxiden, Alkoholen, Ketoncarbonylen und Carboxylgruppen10,11,12 die Dispergierung von GO in wässrigen Medien aufgrund der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen polaren funktionelle Gruppen und Wassermoleküle13,14. Darüber hinaus machen einzigartige Eigenschaften wie wässrige Verarbeitbarkeit, die Hemmwirkung des Bakterienwachstums, die Fähigkeit zur Fluoreszenzlöschung, einfache Skalierbarkeit, kostengünstige Synthese und die Fähigkeit zur Herstellung einer stabilen kolloidalen Suspension GO zu einem potenziellen Kandidaten für verschiedene Anwendungen15,16,17,18. 19,20,21,22,23,24. Es gibt ein breites Spektrum an Bioanwendungen von GO und seinen Derivaten, einschließlich pH-abhängiger Arzneimittelabgabe, Biosensorik, Bioimaging sowie Knochen- und Hautgewebe-Engineering25,26,27,28,29,30,31,32.

GO kann mit synthetischen oder natürlichen Materialien wie Polymeren, Proteinen und Vitaminen kombiniert werden, um seine Unvollkommenheiten, z. B. Zugfestigkeit, Elastizität und Leitfähigkeit, zu verbessern. Folsäure (FA), ein wasserlösliches Vitamin, wird aufgrund seiner geringen Kosten, Kompatibilität in einem biologischen Medium und Nichttoxizität37 häufig in Biomaterialien mit potenziellen Bioanwendungen wie Bildgebungssystemen33,34, therapeutischen Wirkstoffen35 und Arzneimittelträgern36 verwendet . Die Konjugation von FA an die GO-Plattform mittels Amidierung führte zur Herstellung biokompatibler Materialien mit einem breiten Anwendungsspektrum von Biosensoren bis hin zur gezielten Abgabe therapeutischer Wirkstoffe zur Krebsbehandlung, einschließlich Brust-, Eierstock-, Lungen- und Dickdarmkrebs38,39,40.

Seidenfibroin (SF) von Seidenraupen ist ein bekanntes natürliches Protein, das aus Fibroin und Sericin besteht. Der erste baut die Seidenfasern strukturell auf und der zweite fungiert als Klebstoff und bindet die Fibroinfasern zusammen41. SF wurde jahrhundertelang als Nahtmaterial verwendet und gilt heute als potenzieller Kandidat für Biomaterialien und Gerüste für die Gewebezüchtung, da es eine erhebliche mechanische Festigkeit, Elastizität, Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit aufweist42,43,44. Im Vergleich zu anderen Proteinen weist Seide Vorteile wie geringes Infektionsrisiko, kostengünstige Verarbeitung, einfache Isolierung und Reinigung, Verfügbarkeit in großem Maßstab, hervorragende mechanische Eigenschaften, biologische Abbaubarkeit und vor allem das Vorhandensein leicht zugänglicher chemischer Gruppen für funktionelle Modifikationen bei der Konservierung auf seine vorteilhaften intrinsischen Eigenschaften45,46,47,48,49.

Es wurde berichtet, dass Nanobiomaterialien ein günstiges Potenzial für verschiedene Bioanwendungen aufweisen, darunter Nanomedizin50, Pharmakologie51 und biomedizinische Bereiche. Trotz der herausragenden Vorteile von Nanobiomaterialien bestehen bei ihren Anwendungen gewisse Herausforderungen. Beispielsweise können sie erhebliche biologische Nebenwirkungen wie eine Entzündungsreaktion und schließlich den Zelltod verursachen52. Um die Bioanwendungen dieser Nanomaterialien nutzen zu können, müssen ihre Toxizität und Wechselwirkungen mit biologischen Systemen bewertet und berücksichtigt werden. Aufgrund dieser Probleme wurde in dieser Studie GO mithilfe der Hummer-Methode synthetisiert, dann durch kovalente Bindungen mit FA funktionalisiert und schließlich zur Verbesserung seiner Haltbarkeit und zur Herstellung eines Verbundwerkstoffs mit SF gemischt, um das endgültige Nanobiokomposit (GO-FA/SF) herzustellen. mit vorhergesagten Eigenschaften wie Biokompatibilität und Ungiftigkeit.

Mit Ausnahme von Seidenraupenkokons umfassen die chemischen Reagenzien Dimethylschwefelsäure, pulverisierten Graphit, Kaliumpermanganat, wasserfreies Natriumcarbonat, Natriumnitrat, Lithiumbromid, N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), 4-(Dimethylamino)pyridin (DMAP) und Wasserstoff Peroxid, Natriumchlorid und die Dialysemembran (Molekulargewichtsgrenze = 14 kDa) wurden von der Chemiefirma Sigma-Aldrich gekauft. Alle in dieser Studie verwendeten Lösungsmittel und die rauchende Salzsäure (37 %) wurden ebenfalls von der Firma Merck bezogen. Der Mikroorganismusstamm Pseudomonas aeruginosa (ATCCR 27853TM) wurde von der Persian Type Culture Collection (PTCC, Karaj, Iran) bereitgestellt. Das Wachstumsmedium Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) wurde von Gibco BRL Life Technologies bezogen.

Fourier-Transformations-Infrarotspektren (FT-IR) wurden mit einem japanischen Spektrometer Shimadzu FT-8400 s im Bereich von 400–4000 cm−1 unter Verwendung von KBr-Pellets aufgezeichnet. Die morphologischen Eigenschaften, die Größenverteilung und die prozentuale Elementaranalyse der Proben wurden mittels Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM) durchgeführt; (Modell ZEISS-Sigma VP, Deutschland) mit 15 kV Betrieb. Vor der Untersuchung wurden die Proben mit doppelseitigem Kohlenstoffklebeband auf einem Metallstummel befestigt und mit Hilfe einer Gleichstrom-Sputtertechnik (Modell Agar Sputter Coater, Agar Scientific, England) mit einer dünnen Goldschicht bedeckt. Darüber hinaus wurde die Elementzusammensetzung der Probe mit einem energiedispersiven Röntgengerät (EDX) (Modell SAMx, Frankreich) charakterisiert. Darüber hinaus wurde das Verteilungsmuster der Strukturelemente durch Elementkartierungsbilder bestimmt. Das Röntgenbeugungsmuster (XRD) wurde mit dem Brucker-Röntgendiffraktometergerät (D8 Advanced Model, Deutschland) analysiert, das mit Cu-Kα-Strahlung (λ = 0,154 nm, 40 kV, 40 mA) ausgestattet war. Die thermogravimetrische Analyse (TGA) wurde mit dem Gerät Bahr-STA 504 (Deutschland) unter Argonatmosphäre durchgeführt. Die Adsorption der Proben wurde im Zuge der Untersuchung der biologischen Eigenschaften mit einem Mikroplattenlesegerät (STAT FAX 2100, BioTek, Winooski, USA) gemessen53.

Gemäß unseren früheren Arbeiten wurde GO aus nativen Graphitflocken hergestellt und die modifizierte Hummer-Methode23,24,32,54 verwendet. Um die terminalen Carboxyl- und Carbonylgruppen von GO zu aktivieren, wurden 1,85 g DCC und 0,3 g DMAP zu 0,5 g GO-Suspension in 100 ml DMSO gegeben. Die Mischung wurde 20 Minuten lang mit Ultraschall behandelt. Im nächsten Schritt wurden 0,3 g FA zum aktivierten GO hinzugefügt, die Suspension weitere 20 Minuten lang beschallt und die erhaltene Mischung über Nacht gerührt. Danach wurde die Mischung zentrifugiert und zweimal mit destilliertem Wasser und zweimal mit Ethanol gewaschen, um DMSO und jegliches nichtkonjugierte FA aus GO-FA zu entfernen. Abschließend wurde die Mischung mit Aceton gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet, um ein Pulverprodukt zu erhalten.

SF wurde anhand der zuvor beschriebenen Methoden durch Entschleimungs-, Rehydrierungs- und Dialyseschritte aus Kokons extrahiert55,56. Das mit FA dekorierte GO (GO-FA) (0,2 g) wurde einige Minuten lang in destilliertem Wasser beschallt und mit SF-Lösung (5 ml) gemischt. Später wurde die Mischlösung 4 Stunden lang unter Rührbedingungen gehalten. Anschließend wurde die erhaltene Suspensionsmischung zur weiteren Gefriertrocknung in eine Petrischale gegossen. Zu diesem Zweck wurde die Probe 24 Stunden lang in einem Gefrierschrank (−70 °C) aufbewahrt. Anschließend wurde die Petrischale 24 Stunden lang in einen Gefriertrockner gestellt, um das Lösungsmittel zu sublimieren, und der Dehydratisierungsprozess wurde bei –60 °C und einem konstanten Druck (0,1 bar) durchgeführt57.

Zunächst wurden 50 mg Graphenoxid-Folsäure/Seidenfibroin (GO-FA/SF)-Nanobiokomposit in 1 ml RPMI-Medium (Roswell Park Memorial Institute) unter Verwendung eines Schüttelinkubators für 24 Stunden bei 37 °C dispergiert, um einen Nanobiokomposit-Extrakt zu erhalten. Als nächstes wurde ein MTT-Assay durchgeführt, um die Toxizität des GO-FA/SF-Nanobiokomposits zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurde die von der Zellbank des Pasteur Institute of Iran erhaltene Hu02-Zelllinie (menschliche Hautfibroblastenzellen) in 96-Well-Platten (1 × 105 Zellen/Well) unter optimalen Bedingungen (37 °C, 5 % CO2 in) kultiviert befeuchteter Inkubator). Als nächstes wurde das Wachstumsmedium (10 % FBS) entfernt und die Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Neues Erhaltungs-RPMI-Medium einschließlich GO-FA/SF-Extrakt wurde hinzugefügt und die Zellen wurden 24, 48 und 72 Stunden lang inkubiert. Angehängtes RPMI ohne Nanobiokomposit-Extrakt und Zellen in jeder Vertiefung wurden ebenfalls als Negativkontrolle betrachtet. Eine 10-μL-Lösung von frisch zubereitetem 5 mg/ml MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) in PBS wurde in jede Vertiefung gegeben und bei Raumtemperatur inkubiert 37 °C für 4 Stunden. Danach wurde das Medium mit der MTT-Lösung entfernt und Isopropanol in einer Menge von 100 µL/Well hinzugefügt. Anschließend wurden die Platten leicht geschüttelt, um die Solubilisierung der Formazankristalle zu erleichtern58. Die Absorption wurde bei 590 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (STAT FAX 2100, BioTek, Winooski, USA) gemessen. Abschließend wurde der Prozentsatz der Zelltoxizität und Zelllebensfähigkeit wie folgt berechnet59:

Diese Studie wurde gemäß den in der Erklärung von Helsinki dargelegten Grundsätzen durchgeführt. Außerdem wurden die experimentellen Methoden und das Verfahren zur Erhebung der informierten Zufriedenheit von der Ethik-Forschungskommission der Semnan University of Medical Sciences genehmigt und von allen Teilnehmern wurde eine informierte Zustimmung eingeholt. Zunächst wurden 50 mg GO-FA/SF-Nanobiokomposit in 1 ml PBS unter Verwendung eines Schüttelinkubators bei 37 °C mit zwei Extraktionszeiten (24 und 72 Stunden) dispergiert. Als nächstes wurde der hämolytische Assay durchgeführt, um die Hämokompatibilität des GO-FA/SF-Nanobiokomposits auf menschlichen roten Blutkörperchen (RBCs) zu messen. Einem Freiwilligen mit negativer Blutgruppe O wurde eine frische Blutprobe entnommen. Eine nachfolgende Blutprobe wurde in PBS (1:20) verdünnt. Als nächstes wurden 100 μl davon zu 100 μl jedes GO-FA/SF-Extrakts (24 und 72 Stunden) in einer 96-Well-Platte mit drei Wiederholungen hinzugefügt. Als Positivkontrolle wurde in diesem Test 1 % Triton X-100 verwendet, das fast alle Erythrozyten lysiert. Als Negativkontrolle wurde auch eine 0,9 %ige NaCl-Lösung in Betracht gezogen. Die Platte wurde 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, anschließend wurden die Proben entnommen und 15 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert60,61. Die Absorption jeder Probe wurde durch photometrische Analyse des Überstands bei 414 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (STAT FAX 2100, BioTek, Winooski, USA) bestimmt, um die Hämoglobinfreisetzung aufzuzeichnen, die eine RBC-Schädigung darstellt. Abschließend wurde mit der folgenden Formel der Hämolyse-Prozentsatz der Proben berechnet62:

Zur Bewertung der antimikrobiellen Eigenschaften von GO-FA/SF wurde ein Gewebekulturplatten-Anti-Biofilm-Assay (TCP) verwendet. Zunächst wurden Nanobiokomposit- und Polystyrolstücke (als Positivkontrolle) mit einer Größe von 1 cm2 in 70 %iger wässriger Ethanollösung sterilisiert und in einem sterilisierten Inkubator bei 37 °C getrocknet. Anschließend wurden die ausgewählten Bakterien (P. aeruginosa ATCC 27.853) in einer Konzentration von 107 koloniebildenden Einheiten (KBE)/ml in Nährbrühe (NB) in sterilisierten Röhrchen vorbereitet und jedes Stück hineingegeben. Beide Röhrchen wurden in einem Schüttelinkubator bei 150 U/min und 37 °C 24 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden die Proben aus den Röhrchen entnommen und zweimal mit PBS-Lösung gewaschen. Anschließend wurden beide Proben 5 Minuten lang mit 0,1 %iger Kristallviolettlösung gefärbt. Anschließend wurde es mit 33 %iger Essigsäurelösung gewaschen, um die Bakterien von ihrer Oberfläche zu trennen. Abschließend wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (STAT FAX 2100, BioTek, Winooski, USA) die Absorption der resultierenden Lösungen bei 570 nm63,64 bewertet.

Ein t-Test führte eine statistische Analyse durch, um alle Ergebnisse mit der Software SPSS Statistics 22.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, USA) zu vergleichen. Die Werte von P \(\ge\) 0,05 (*), P \(\le\) 0,05 (**) und P \(\le\) 0,001 (***) wurden als statistisch insignifikant, signifikant und angesehen jeweils sehr bedeutsam.

Zur Herstellung eines GO-FA/SF-Biokomposits in Nanogröße wurden GO-Nanoflocken, FA-Vitamin und frisches SF-Protein verwendet. Vier Syntheseschritte führten das Syntheseverfahren durch. Zunächst wurde GO mit der modifizierten Hummer-Methode synthetisiert. Zweitens wurde es mit FA funktionalisiert, indem die Carbonsäure von GO mit dem Aminterminal von FA gekoppelt wurde. Drittens wurde SF-Protein mithilfe der Entschleimungsmethode aus Seidenraupenkokons extrahiert. Abschließend wird das oberflächenfunktionalisierte GO (GO-FA) mithilfe eines Gefriertrocknungsverfahrens mit extrahiertem SF vermischt. Der gesamte Synthesevorgang ist in Abb. 1 dargestellt.

Syntheseprozess des GO-FA/SF-Nanobiokomposits.

Nach der Synthese und Herstellung des endgültigen Nanobiokomposits wurde auch dessen strukturelle Charakterisierung mithilfe verschiedener Techniken durchgeführt, darunter FT-IR, FE-SEM, EDX, XRD und TGA. Im folgenden Abschnitt wird jede Analyse ebenfalls besprochen.

Der Erfolg der Nanobiokomposit-Herstellung wird durch die Analyse der FT-IR-Spektren der Ausgangs-GO-Plattform, des GO-FA-Konjugats und des endgültigen GO-FA/SF-Gerüsts bestätigt. Wie im Spektrum von synthetischem GO (Abb. 2A) gezeigt, wurde eine breite Bande im Bereich von 3400–3350 cm-1 dem Streckschwingungsmodus der Hydroxylgruppen (–OH)65 zugeordnet. Zwei unterschiedliche Absorptionsbanden bei 1728 und 1622 cm-1 werden den Streckschwingungsmoden der Carboxylgruppe (C=O) bzw. der nichtoxidierten Graphitdomäne (C=C) zugeschrieben 66. Außerdem sind kleine Absorptionsbanden mit der Streckschwingung verbunden Der Schwingungsmodus der Alkoholgruppen (C–OH) und der Streckschwingungsmodus der Epoxid- und Alkoxygruppen (CO) wurden bei 1222 und 1051 cm-167 beobachtet. In Bezug auf Abb. 2B konnte die Amidbindungsbildung während der FA-Konjugation durch das Vorhandensein der Streckschwingung von (N-H) im Bereich von (3470–3320 cm-1) und der Biegeschwingung von (N-H) bei 1570 charakterisiert werden cm-1 und die Streckschwingung von (CN) der aliphatischen Amingruppe bei 1218 cm-168. Die charakteristischen Peaks im Zusammenhang mit GO wurden bei 1630, 1238 und 1045 cm-1 beobachtet, was auf C=C-, C-OH- bzw. C-OR-Schwingungen zurückzuführen ist. Aus der Literatur geht hervor, dass SF durch drei Schwingungsbanden in drei Regionen charakterisiert werden kann, darunter (1660–1625 cm-1), (1540–1520 cm-1) und (1270–1230 cm-1). (C=O)-Streckschwingungsmodus von Amid I, der (N-H)-Biegeschwingungsmodus von Amid II bzw. der (CN)-Streckschwingungsmodus von Amid III 54,69. Vor diesem Hintergrund bestätigten die oben erwähnten SF-Peaks, die bei 1660 cm-1 (Random Coil), 1533 cm-1 (Random Coil) und 1272 cm-1 (β-Faltblatt) auftraten, das Vorhandensein von SF-Fäden in der hergestellten Nanobiokompositstruktur . Wie in Abb. 2C gezeigt, wurde die Zuordnung der Absorptionsbanden bei 1280 und 1078 cm−1 den C-OH- und C-OR-Streckschwingungsmodi von GO zugeschrieben. Es ist auch besser zu erwähnen, dass die charakteristischen Peaks von GO im Zusammenhang mit C=O- und C=C-Schwingungen von scharfen Peaks überlagert wurden, die SF-Zufallsspulenvibrationen im Bereich von 1660–1533 cm−1 zugeschrieben werden.

FT-IR-Spektren von GO (A), GO-FA (B) und GO-FA/SF-Nanobiokompositgerüst (C).

Die strukturelle Charakterisierung der synthetisierten GO-FA- und GO-FA/SF-Verbundwerkstoffe wurde mithilfe energiedispersiver Röntgenspektroskopie durchgeführt, um die Elementzusammensetzung zu ermitteln. Wie in Abb. 3A und B dargestellt, bestätigen das Vorhandensein von zwei starken Peaks im Zusammenhang mit Kohlenstoff- und Sauerstoffelementen und die Beobachtung von Stickstoffsignalen die Herstellung von GO bzw. seine Funktionalisierung mit FA. Am wichtigsten ist, dass der Anstieg des Stickstoffgehalts von 3,3 auf 5,8 Gew.-% (Abb. 3B) zeigte, dass das SF im letzten Schritt erfolgreich mit dem GO-FA-Komposit verbunden wurde, da SF zusätzliches Stickstoffelement zum endgültigen Bionanokomposit mitbrachte.

EDX-Spektrum der Bionanokomposite GO-FA (A) und GO-FA/SF (B).

Die morphologische Charakterisierung des Ausgangs-GO und des endgültigen GO-FA/SF-Nanobiokomposits wurde mittels Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie FE-SEM durchgeführt. Wie in Abb. 4A dargestellt, ist die Schichtstruktur von GO-Flocken mit wellenförmiger Morphologie offensichtlich. Betrachtet man Abb. 4B, zeigt sich nach der Funktionalisierung von GO-Folien mit FA-Ketten und ihrer Modifikation mit SF-Polymeren, dass das modifizierte GO eine glatte unilamellare Morphologie mit verringerter Robustheit aufwies, während es seine charakteristische Struktur beibehielt, die in den nativen GO-Flocken beobachtet wurde.

Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bilder von (A) GO, (B) GO-FA/SF-Nanobiokomposit im Maßstab 200 nm.

Röntgenbeugung (XRD) wurde verwendet, um die Kristallphase zu untersuchen und den Zwischenschichtabstand für GO und den endgültigen GO-FA/SF-Verbund zu bestimmen. Wie in Abb. 5A dargestellt, zeigte GO einen scharfen charakteristischen Peak bei 2θ = 10,7º (002) mit einem Zwischenschicht-d-Abstand von 0,82 nm, der GO-Blättern entspricht70. Abbildung 5B zeigt die teilkristalline Natur des GO-FA/SF-Komposits, da GO mit FA funktionalisiert und mit SF beladen wurde. Wie in Abb. 5B dargestellt, wurde der gut definierte Peak von GO bei 2θ = 7,8º mit einem vergrößerten d-Abstand zwischen den Schichten von 11,2 nm beobachtet, der sich im Vergleich zu nativem GO zu einem geringeren Beugungswinkel verschob. Der Literatur zufolge führte die Zunahme der sauerstoffhaltigen Gruppen in der GO-Plattform zu einem geringeren Winkelgrad71. Andererseits kann der Einschluss von Wassermolekülen zwischen den GO-Schichten den d-Abstand der GO-Schichten vergrößern72. Außerdem können einige Beugungen (2θ = 15,6º, 22,0º, 28,8º) beobachtet werden, was auf die halbkristalline Natur des in der Verbundstruktur vorhandenen FA hinweist73. Auch die Beobachtung der kristallinen Peaks bei 2θ = 9,3°, 20,1° bestätigt das Vorhandensein von SF mit seiner Seiden-II-Kristallkonformation im hergestellten Bionanokomposit74.

XRD-Muster von (A) GO, (B) entworfenem GO-FA/SF-Nanobiokomposit.

Die thermogravimetrische Analyse wurde durchgeführt, um die thermische Stabilität des hergestellten GO-FA/SF-Nanobiokomposits zu überprüfen. Abbildung 6 zeigt den Massenverlust der Probe als Funktion der Temperatur und zeigt, dass der Produktverbund hauptsächlich in vier Schritten abgebaut wird. Den veröffentlichten Ergebnissen zufolge ist der erste signifikante Massenverlust bei fast 170–260 °C (ca. 40 %) hauptsächlich auf die Zersetzung sauerstoffhaltiger funktioneller Gruppen von GO wie Epoxid-, Hydroxyl- und Carboxylgruppen zurückzuführen, wodurch CO und CO275 entstehen ,76,77. Die zweite Massenreduktion bei einem Temperaturbereich von 260–310 °C (≈14 %) entspricht der Zersetzung der FA-Einheiten, die die GO-Plattform funktionalisiert haben73. Wir können also berechnen, dass das Komposit etwa 0,28 mg FA enthält. Der dritte Abbaubereich bei 310–455 °C (≈12 %) könnte durch die Spaltung von Peptidbindungen und den Abbau der Seitenkettengruppe von Aminosäuren im Zusammenhang mit dem SF-Protein in der Nanobiokompositstruktur erklärt werden78,79. Nach dem Temperaturanstieg auf 800 °C bezieht sich der Massenverlust von ca. 34 % auf die Zersetzung aller verbleibenden Einheiten mit fast allen Resten.

Thermogravimetrische Kurve des GO-FA/SF-Nanobiokomposits.

Wie in Abb. 7 gezeigt, betrugen die Lebensfähigkeitsprozentsätze der mit GO-FA/SF-Nanobiokomposit behandelten Hu02-Zellen nach 24 und 48 Stunden Inkubation 96,67 bzw. 96,35 %. Dieser Wert stieg nach 72 Stunden Inkubation auf 97,23 %. Außerdem wurde die Wirkung des GO-FA/SF-Nanobiokomposits auf die Morphologie und Form von Hu02-Zellen nach 72-stündiger Inkubation mit einem Umkehrmikroskop abgebildet. Es wird darauf hingewiesen, dass Hu02-Zellen nach der Behandlung mit GO-FA/SF ihre Fibroblastenform behalten. Die Ergebnisse sind der Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten. Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass das GO-FA/SF-Nanobiokomposit keine toxischen Wirkungen auf Hu02-Zellen hatte.

Bild einer 96-Well-Platte für den MTT-Assay auf der Hu02-Zelllinie (A) und Histogramm des Zelllebensfähigkeitsprozentsatzes (B) nach unterschiedlichen Inkubationszeiten des Nanobiokomposits (* = unbedeutend, P \(\ge\) 0,05 (. Unbehandelte Hu02-Zelle Linienmorphologie (C) und Hu02-Zelllinienmorphologie nach Behandlung mit GO-FA/SF-Nanobiokomposit nach 72-stündiger Inkubation (D).

Die Testergebnisse, bei denen die Ergebnisse der drei unabhängigen Experimente gemittelt wurden, zeigten, dass die hämolytischen Wirkungen des Nanobiokomposit-Extrakts nach unterschiedlichen Extraktionszeiten (24 und 72 Stunden) unter 10 % lagen, während 1 % Triton X-100 fast alle Erythrozyten lysierte. (P \(\le\) 0,001) (Abb. 8). Basierend auf den Ergebnissen kann gesagt werden, dass das GO-FA/SF-Nanobiokomposit hämokompatibel ist.

Hämolysehistogramm von 1 % Triton ) 0,05, *** = sehr signifikant, P \(\le\) 0,001)), wird mit 96-Well-Plattenbild geliefert.

Wie in Abb. 9 gezeigt, betrug die Adsorptionsrate von Polystyrol (als Positivkontrolle) bei 570 nm 0,76, was für GO-FA/SF-Nanobiokomposit auf 0,63 reduziert wurde. Es zeigte also eine geringe Anti-Biofilm-Wirkung. Die angegebenen Werte sind der Durchschnitt aus drei unabhängigen Wiederholungen des Experiments.

Das Anti-Biofilm-Histogramm von Polystyrol- und GO-FA/SF-Nanobiokompositstücken (* = unbedeutend, P \(\ge\) 0,05) wird mit einem 96-Well-Plattenbild geliefert.

Diese Studie entwarf und fertigte ein neuartiges Nanobiokomposit unter Verwendung ungiftiger und kostengünstiger Ausgangsmaterialien. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde GO mit der modifizierten Hummer-Methode synthetisiert, mit FA funktionalisiert und dann einfach mit extrahiertem SF konjugiert. Die Reihe biologischer Tests zeigte bemerkenswerte Merkmale des erhaltenen GO-FA/SF-Bionanokomposits. Der MTT-Assay zeigte, dass die Behandlung von Hu02-Zellen mit GO-FA/SF-Nanobiokomposit über 24, 48 und 72 Stunden Inkubationszeit zu 96,67 %, 96,35 % und 97,23 % Lebensfähigkeitsprozentsätzen bei Beibehaltung ihrer Fibroblastenform führte, was insgesamt bestätigt Biokompatibilität und Nichttoxizität des GO-FA/SF-Nanobiokomposits gegenüber Hu02-Zellen. Um die Hämokompatibilität des hergestellten Nanobiokomposits zu erklären, wurde der Hämolysetest durchgeführt und der Hämolyseprozentsatz von 7,88 und 8,62 % für 24- und 72-stündige Extraktionszeiten ermittelt. Die Ergebnisse des Anti-Biofilm-Assays zeigten, dass das hergestellte Nanobiokomposit-Gerüst die Bildung von P. aeruginosa-Biofilmen auf seiner Oberfläche gut hemmen konnte. Angesichts der strukturellen Eigenschaften und der zufriedenstellenden Ergebnisse biologischer Tests könnte dieses neuartige Nanobiokomposit eher für biomedizinische Anwendungen wie Wundheilung und Gewebezüchtung eingesetzt werden.

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Die Autoren bedanken sich für die teilweise Unterstützung durch den Forschungsrat der Iranischen Universität für Wissenschaft und Technologie. Außerdem danken die Autoren dem Ethics Research Committee und dem Biotechnology Research Center der Semnan University of Medical Sciences.

Forschungslabor für Katalysatoren und organische Synthese, Abteilung für Chemie, Iranische Universität für Wissenschaft und Technologie, 16846-13114, Teheran, Iran

Reza Eivazzadeh-Keihan, Farkhondeh Alimirzaloo und Ali Maleki

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Hooman Aghamirza Moghim Aliabadi

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Hooman Aghamirza Moghim Aliabadi

Abteilung für Anorganische Chemie, Fakultät für Chemie, Universität Tabriz, Tabriz, Iran

Ehsan Bahojb Noruzi

Fakultät für Chemie, Iranische Universität für Wissenschaft und Technologie, 16846-13114, Teheran, Iran

Ali Reza Akbarzadeh

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Hamid Madanchi

Abteilung für Arzneimitteldesign und Bioinformatik, Abteilung für medizinische Biotechnologie, Forschungszentrum für Biotechnologie, Pasteur-Institut des Iran, Teheran, Iran

Hamid Madanchi

Forschungszentrum für Endokrinologie und Stoffwechsel, Institut für klinische Wissenschaften für Endokrinologie und Stoffwechsel, Medizinische Universität Teheran, Teheran, Iran

Mohammad Mahdavi

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RE-K.: Wesentliche Beiträge zur Konzeption, zum Design der Arbeit, zum Entwurf der Arbeit, zum Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, zur Analyse und Interpretation von Daten und zum Verfassen des Hauptmanuskripts. FA: Habe die Arbeit entworfen, die Daten analysiert und interpretiert und sie inhaltlich überarbeitet. HAMA: Analyse und Interpretation der Daten, inhaltliche Überarbeitung, Erstellung des Hauptmanuskripts und Erstellung von Zahlen; EBN: Analyse und Interpretation der Daten, inhaltliche Überarbeitung und Erstellung des Hauptmanuskripts. ARA: Analyse und Interpretation der Daten, inhaltliche Überarbeitung. MM: Der korrespondierende Autor der aktuellen Studie, Analyse und Interpretation von Daten, hat sie inhaltlich überarbeitet. AM: Der Hauptkorrespondierende (einreichende) Autor der aktuellen Studie hat wesentliche Beiträge zur Konzeption und Gestaltung des Werks geleistet, das Werk entworfen, geschrieben – überprüft und bearbeitet und es inhaltlich überarbeitet. HM: Der korrespondierende Autor der aktuellen Studie, Analyse und Interpretation von Daten, hat sie inhaltlich überarbeitet. Alle Autoren sind sich der ethischen Genehmigung, der im Manuskript befolgten Richtlinien und der Einholung der Einverständniserklärung aller Teilnehmer bewusst. Abbildung 1 wurde von unserem Co-Autor (Ehsan Bahojb Noruzid) gezeichnet, Abb. 7, 8 und 9: 3. Co-Autor (Hooman Aghamirza Moghim Aliabadi).

Korrespondenz mit Ali Maleki, Hamid Madanchi oder Mohammad Mahdavi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Eivazzadeh-Keihan, R., Alimirzaloo, F., Aghamirza Moghim Aliabadi, H. et al. Funktionalisierte Graphenoxid-Nanoblätter mit Folsäure und Seidenfibroin als neuartiges Nanobiokomposit für biomedizinische Anwendungen. Sci Rep 12, 6205 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-10212-0

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Eingegangen: 07. Oktober 2021

Angenommen: 21. März 2022

Veröffentlicht: 13. April 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-10212-0

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